GX液相色譜儀結構

　　GX液相色譜儀一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等。

一、輸液泵

　　1、泵的構造和性能

　　輸液泵是GX液相色譜儀中Z重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應<0.5%，這對定性定量的準確性至關重要;②流量范圍寬，分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100ml/min;③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好，耐腐蝕。

　　GX液相色譜儀泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩定;螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應用Z多的是柱塞往復泵。

　　柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫;改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱阻影響;泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好(RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%)，但出故障的機會較多(因多一單向閥)，價格也較貴。

　　2、泵的使用和維護注意事項

　　為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性，必須按照下列注意事項進行操作：

　　①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相Z好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜(0.2μm或0.45μm)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

　　②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水)。

　　③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，Z終產生漏液。

　　④輸液泵的工作壓力決不要超過規定的Zgao壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液。

　　⑤流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。

　　3、梯度洗脫

　　GX液相色譜儀有等強度和梯度洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數目較少，性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現性。

　　梯度洗脫有兩種實現方式：低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內梯度)。

　　兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度Z常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。

　　在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：

　　①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

　　②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。

　　③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的Zda壓力。

　　④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。

二、進樣器

　　早期GX液相色譜儀使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處。現在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證ZX進樣，進樣時對色譜系統的壓力、流量影響小。GX液相色譜儀進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。

　　1、隔膜進樣：

　　用微量注射器將樣品注入專門設計的與色譜柱相連的進樣頭內，可把樣品直接送到柱頭填充床的ZX，死體積幾乎等于零，可以獲得Z佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產生記憶效應，使進樣重復性只能達到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規分析使用受到限制。

　　2、停流進樣：

　　可避免在高壓下進樣。但在GX液相色譜儀中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現“鬼峰”;另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。

　　3、閥進樣：

　　一般GX液相色譜儀分析常用六通進樣閥，其關鍵部件由圓形密封墊(轉子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進樣量準確，重復性好(0.5%)，操作方便。

　　六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%(Z多75%)，并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍(Z少3倍)，這樣才能完全置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。

　　六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的Zda壓力;再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

　　4、自動進樣：

　　用于大量樣品的常規分析。

三、色譜柱

　　色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。用于GX液相色譜儀的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等，其粒度一般為3、5、7、10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效;對于同系物分析，只要500即可;對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。

　　柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到Z佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使Z好的裝填技術，在柱ZX部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。

　　1、柱的構造

　　色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不銹鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不銹鋼柱內壁涂敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

　　色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱(常量柱)，內徑2~5mm(常用4.6mm，國內有4mm和5mm)，柱長10~30cm;②窄徑柱(narrowbore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn)，內徑1~2mm，柱長10~20cm;③毛細管柱(又稱微柱microcolumn)，內徑0.2~0.5mm;④半制備柱，內徑>5mm;⑤實驗室制備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm;⑥生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

　　2、柱的發展方向

　　因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質譜(MS)聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小于0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優點是：①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實現LC-MS聯用。

　　但由于柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進樣閥能準確、重復地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。

　　3、柱的填充和性能評價

　　色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度>20μm時，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充;②徑向加壓法，WatersZL;③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。

　　必須指出，GX液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在于填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。

　　無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。

　　一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

四、檢測器

　　檢測器是GX液相色譜儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。GX液相色譜儀的檢測器要求靈敏度高、噪音低(即對溫度、流量等外界變化不敏感)、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。

　　1、分類

　　①按原理可分為光學檢測器(如紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射)、熱學檢測器(如吸附熱)、電化學檢測器(如極譜、庫侖、安培)、電學檢測器(電導、介電常數、壓電石英頻率)、放射性檢測器(閃爍計數、電子捕獲、氦離子化)以及氫火焰離子化檢測器。

　　②按測量性質可分為通用型和專屬型(又稱選擇性)。通用型檢測器測量的是一般物質均具有的性質，它對溶劑和溶質組分均有反應，如示差折光、蒸發光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發射的組分有響應。

　　③按檢測方式分為濃度型和質量型。濃度型檢測器的響應與流動相中組分的濃度有關，質量型檢測器的響應與單位時間內通過檢測器的組分的量有關。

　　④檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。

　　2、性能指標

　　①噪音和漂移：在GX液相色譜儀穩定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速(泵的脈動)和溶劑(純度、含有氣泡、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。

　　②靈敏度：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質量型檢測器，它表示在單位時間內通過檢測器的單位質量的樣品所產生的電信號的大小，單位為mV·s/g。

　　③檢測限：檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測Z小樣品量或Zdi樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關的。

　　檢測限指恰好產生可辨別的信號(通常用2倍或3倍噪音表示)時進入檢測器的某組分的量(對濃度型檢測器指在流動相中的濃度——注意與分析方法檢測限的區別，單位g/ml或mg/ml;對質量型檢測器指的是單位時間內進入檢測器的量，單位g/s或mg/s)。又稱為敏感度。D=2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標準溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。

　　檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關。

　　④線性范圍：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍，即在固定靈敏度下，Zda與Z小進樣量(濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度)之比。也可用響應信號的Zda與Z小的范圍表示。

　　定量分析的準確與否，關鍵在于檢測器所產生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數關系。輸出信號與樣品量Z好呈線性關系，這樣進行定量測定時既準確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內呈線性響應。通常A=BCx，B為響應因子，當x=1時，為線性響應。對大多數檢測器來說，x只在一定范圍內才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認為它是呈線性的。

　　線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。

　　⑤池體積：除制備色譜外，大多數GX液相色譜儀檢測器的池體積都小于10μl。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2μl甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。

　　3、紫外檢測器

　　UV檢測器是GX液相色譜儀中應用Z廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度(實際是提高檢測限)。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。

　　注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A=1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。

　　UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長(單通道)檢測器和雙波長(雙通道)檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性(確證是否是單一純物質)，色譜用于定量。常用于復雜樣品(如生物樣品、中草藥)的定性定量分析。

五、數據處理和計算機控制系統

　　早期的GX液相色譜儀是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使GX液相色譜儀操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據;②控制儀器;③色譜系統優化和專家系統。

六、恒溫裝置

　　在GX液相色譜儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。

　　溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大;還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。

　　色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響;但如使用硬質填料則影響不大。

　　總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(如緩沖劑)加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。

　　不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和Z小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。