共聚焦顯微鏡的使用方法|注意事項

　　共聚焦顯微鏡與傳統顯微鏡相比，具有高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點。隨著軟件開發和應用技術的完善，共聚焦顯微鏡已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等領域中新一代強有力的研究工具。

共聚焦顯微鏡的樣品制備

　　共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測前的關鍵步驟。樣品需經熒光探劑標記(單標、雙標、三標)。

　　標本可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養，細胞應培養在Confocal專用小培養皿或蓋玻片上，懸浮細胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm，使用的蓋玻片厚度應小于0.17mm，載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間，而且表面光潔，厚度均勻，沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

　　常規樣品制備要求：

　　1、染料的選擇

　　由于共聚焦顯微鏡是以單一波長的激光作為光源，因此在選擇熒光染料時要根據共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇，如果在同一樣品中有多種熒光染料標記，還要考慮它們的發射波長盡量不要重疊，避免串色問題。

　　2、樣品承載物的選擇

　　一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡，它的數值孔徑較小，要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm，因此如果觀察樣品為貼壁細胞或組織切片，可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細胞或懸浮粒子，可以用共聚焦顯微鏡專用的培養皿承載樣品進行觀察。

　　3、封片劑的選擇

　　如果樣品只需要觀測一次并且不是極易淬滅的熒光，可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時間并多次拍攝，應選用抗熒光淬滅的封片劑，以減少熒光信號丟失。

徠卡 共聚焦顯微鏡 STELLARIS

共聚焦顯微鏡的操作步驟

　　①根據熒光探針的激發波長和發射波長，選擇合適的激光器、激光功率，分光鏡濾片和發射濾片。

　　②確定掃描方式：點、線、面、三維掃描。

　　③確定掃描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但也越容易發生光漂白。

　　④選取共聚焦顯微鏡物鏡的倍數及電子放大倍數:這個條件被確定后，掃描范圍即被確定，物鏡的光透射率與數值孔徑(NA)的4次方成正比，與物鏡的放大倍數的平方成反比，因此，應盡量選擇高數值孔徑的物鏡。

　　⑤根據樣品的制備質量選擇合適的針孔大小，調整激光管電壓、光電倍增管功率、降噪等至Z佳狀態，這些參數選擇或設置有非常密切的關系，選擇時應綜合考慮。

　　⑥確定光切范圍，即掃描樣品的厚度，鎖定起始位置和結束位置。

　　⑦給出光切的層數及取圖時累計平均次數。

　　⑧獲取圖像并保存。

共聚焦顯微鏡使用注意事項

　　使用共聚焦顯微鏡，必須注意以下幾點：

　　①嚴格按照使用規程操作，不得任意改變操作程序，共聚焦顯微鏡中的激光發射管使用壽命有限且價格昂貴。所以，在操作使用過程中切記，在開關的啟動順序以及在掃描過程中努力做到保護好激光管。

　　②注意不要暴露在中等功率和高功率的激光輻射中，特別要注意不得注視激光束，甚至不要觀看樣品：不得在共聚焦顯微鏡附近儲存或使用易燃易爆物的同體、液體或氣體：可以引燃的材料如布或紙張不得放入光路中。

　　③開機或改變激光功率后，約需20min激光光源才能夠達到穩定，關閉共聚焦顯微鏡系統時，先關閉計算機，等氬離予激光器風扇關閉時，方可關閉系統開關。

　　④掃描后的圖像儲存在計算機內，可作進一步處理。由于計算機的硬盤有限，應及時儲存到用戶軟盤上，但要警惕任何病毒浸染激光共聚焦顯微系統。使用前要嚴格把關，檢查軟盤是否攜帶病毒。

共聚焦顯微鏡系統的日常管理

　　共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，它的正常運轉離不開科學的日常管理。

　　1、負責人管理制度

　　為共聚焦顯微鏡指定儀器負責人，由專人負責儀器的開關機，規范的開關機對于共聚焦顯微鏡，尤其是激光器及汞燈的維護極為重要，并由負責人每天檢查儀器的運行狀態。

　　2、儀器預約使用

　　激光器和汞燈均屬于耗材性的配件，使用壽命有限。尤其是激光器，價格昂貴，在幾萬至幾十萬元不等。充分利用好儀器的開機時間，避免共聚焦顯微鏡空轉顯得格外重要。一旦出現超過半小時以上的空檔時間，由共聚焦顯微鏡負責人及時協調儀器使用，通知預約較晚時間點的人員提前使用，避免共聚焦顯微鏡開機空轉造成的浪費。

　　3、使用光盤或者網盤保存數據

　　嚴禁插拔U盤或者硬盤拷貝數據，使用儀器共享管理系統的網盤傳輸或者光盤刻錄數據結果，杜絕病毒侵染共聚焦顯微鏡系統。