瓊脂糖凝膠電泳的操作流程

以瓊脂或瓊脂糖作為支持介質的一種電泳方法，稱為瓊脂糖凝膠電泳。通常采用較大孔徑的瓊脂糖凝膠電泳分離如大分子核酸、病毒等分子量較大的樣品。

操作流程

準備干凈的配膠板和電泳槽

值得注意的是，如果使用了DNA酶污染的儀器，可能會使得DNA降解，導致條帶信號弱、模糊甚至缺失。對于巨大DNA鏈，普通電泳不適合，應該使用脈沖凝膠電泳。

選擇合適的電泳方法

瓊脂糖凝膠電泳能夠對一般的核酸進行檢測。若對于電泳的分辨率要求非常的高，尤其是差別僅有幾個bp，應該選用聚丙烯酰胺凝膠電泳。若巨大的DNA鏈使用普通電泳，則有可能造成缺帶。

選擇合適的凝膠濃度

瓊脂糖凝膠電泳濃度一般在0.5～2%之間，小片段核酸使用高濃度的進行分析，大片段核酸使用低濃度的進行分析。低濃度膠易碎，比較好的解決辦法是瓊脂糖選擇質量好的和操作小心。值得注意的是高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失。

選擇合適的緩沖液

TAE和TBE為常用的緩沖液，和TAE相比較，TBE緩沖能力更加的好。電泳時使用新制的緩沖液能夠使電泳效果得到明顯的提高。注意電泳緩沖液多次使用后，使得離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

選擇合適的電壓和溫度

電泳時電泳溫度應該低于30℃，電泳時電場強度應該不高于20V/cm，如果是巨大的DNA電泳，那么溫度應該低于15℃。若電泳時有過高的電壓和溫度，那么可能造成條帶模糊和不規則的DNA帶遷移現象的發生。尤其是太大的電壓可能造成致小片段跑出膠而出現缺帶。

準備合適的DNA樣品的純度和狀態

導致產生條帶模糊和條帶缺失的現象的發生可能是由于樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白，乙醇沉淀能夠將多余的鹽去除，蛋白能夠用酚去除。變性的DNA樣品可能造成條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以預防DNA變性。

正確的DNA的上樣

正確的DNA上樣量能夠確保條帶清晰，DNA上樣量過多可能造成DNA帶型模糊，DNA上樣量過少可能造成帶信號弱甚至缺失。

選擇合適的Marker

DNA電泳估計DNA片段大小一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣才能對目標片段大小作比較準確的估計。Marker的電泳同樣也要與DNA電泳的操作標準相符合。

凝膠的染色和觀察

溴化乙錠（EB）是實驗室常用的核酸染色劑，其具有很好的染色效果，非常方便的操作，然而卻沒有很好的穩定性并且具有毒性。觀察凝膠時應該以染料的不同為依據對合適的光源和激發波長進行使用。若激發波長不對，那么條帶就不容易觀察，會出現條帶模糊的現象。