通過整合BioLector XT高通量生物反應(yīng)器、Biomek i5自動(dòng)化工作站及SCIEX Triple Quad 7500系統(tǒng)，建立了一套高效工藝開發(fā)方案。優(yōu)化篩選三脫氫莽草酸產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)條件40%葡萄糖濃度+指數(shù)補(bǔ)料策略*。本文提取關(guān)鍵操作參數(shù)與數(shù)據(jù)結(jié)論為工業(yè)微生物工藝開發(fā)提供參考。
整合設(shè)備
BioLector XT：
實(shí)時(shí)監(jiān)測pH、溶解氧 (DO) 、生物量，熒光支持32孔通量微流控梅花板的補(bǔ)料和pH調(diào)控并行實(shí)驗(yàn)。
Biomek i5 SPAN-8：
全自動(dòng)完成培養(yǎng)基配置（誤差<2%）、接種及收樣。
圖1：BioLector XT高通量微型生物反應(yīng)器與Biomek i5自動(dòng)化工作站的整合設(shè)備Biomektor
產(chǎn)物檢測設(shè)備
SCIEX質(zhì)譜：
通過離子對 (Q1/Q3=171.1/109) 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物精準(zhǔn)定量 (RSD<5%) 。
圖2：SCIEX Triple Quad 7500三重四極桿質(zhì)譜儀
實(shí)驗(yàn)條件
本研究利用BioLection 5.6軟件在32孔微流控梅花板中構(gòu)建微生物培養(yǎng)體系，通過集成pH調(diào)控與梯度補(bǔ)料策略優(yōu)化菌株生長環(huán)境。系統(tǒng)設(shè)定37°C恒溫及1000 rpm振蕩培養(yǎng)，采用氧氣上調(diào)通氣預(yù)防溶氧限制。實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)pH控制策略，在培養(yǎng)1小時(shí)后啟動(dòng)3M NaOH自動(dòng)滴定維持pH=6.9。
6小時(shí)后在培養(yǎng)孔中實(shí)施三因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：3種葡萄糖濃度 (10%/20%/40%) 分別與3種補(bǔ)料模式（恒定*、線性*、指數(shù)*）組合，同時(shí)設(shè)置第7列（僅恒定補(bǔ)料）、第8列（僅pH調(diào)控）作為對照。微流控模塊通過A/B行儲液孔（分別裝載pH調(diào)節(jié)劑和補(bǔ)料基質(zhì)）實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)流體控制，Biomass/pH/DO三參數(shù)在線監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)時(shí)追蹤培養(yǎng)動(dòng)態(tài)。該設(shè)計(jì)通過空間矩陣排布實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)條件的高通量篩選。
表1：*恒定、線性、指數(shù)分別為設(shè)計(jì)優(yōu)化的補(bǔ)料公式
菌株自動(dòng)化接種
研究采用RoboLector Agent軟件與Biomek i5 SPAN-8自動(dòng)化移液系統(tǒng)整合，實(shí)現(xiàn)高通量菌株接種。通過設(shè)定絕對時(shí)間觸發(fā) (Abs.Time=0 h) ，在BioLector XT持續(xù)振搖 (1000 rpm) 條件下，以Dosing模式向32孔梅花板每孔精準(zhǔn)注入20 μL菌液，確保接種同步性與均一性。
圖3：Biomek i5與BioLector XT整合使用臺面布局
培養(yǎng)液智能化收樣
基于預(yù)設(shè)時(shí)間觸發(fā) (Abs.Time=20 h) ，通過RoboLector Agent調(diào)用Biomek i5 SPAN-8系統(tǒng)完成培養(yǎng)終止與樣本采集。利用可水洗移液針在持續(xù)培養(yǎng)環(huán)境中，從每孔中定量抽取800 μL培養(yǎng)液至收樣孔板，實(shí)現(xiàn)無污染、高精度收樣，保障后續(xù)分析數(shù)據(jù)可靠性（圖4）。該流程集成設(shè)備聯(lián)動(dòng)與程序化控制，支持高通量培養(yǎng)體系的閉環(huán)管理。
圖4：RoboLector Agent中的培養(yǎng)體系收樣Trigger設(shè)置
實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵結(jié)果分析
在線監(jiān)測顯示，補(bǔ)料策略顯著影響菌株生長與產(chǎn)物合成：在10%葡萄糖+恒定補(bǔ)料條件下生物量最高，但三脫氫莽草酸最大產(chǎn)量 (1.877 mg/mL) 出現(xiàn)在40%葡萄糖+指數(shù)補(bǔ)料模式。pH動(dòng)態(tài)調(diào)控（維持6.9）有效緩解菌體產(chǎn)酸導(dǎo)致的生長抑制，未調(diào)控組pH降至4時(shí)生長停滯。補(bǔ)料體積數(shù)據(jù)揭示不同策略的基質(zhì)供給差異，指數(shù)補(bǔ)料更適配高濃度葡萄糖代謝需求。
圖5：使用BioLection 5.6軟件分析的產(chǎn)三脫氫莽草酸的E.coil工程菌Biomass菌株生長情況
表2：使用SCIEX液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測試每個(gè)培養(yǎng)孔的三脫氫莽草酸產(chǎn)量（計(jì)算平行孔的平均值結(jié)果）
高通量自動(dòng)化系統(tǒng)效能驗(yàn)證
整合BioLector XT與Biomek i5的Biomektor系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了全流程自動(dòng)化：
pH/DO實(shí)時(shí)調(diào)控、梯度補(bǔ)料（32孔微流控）；
接種/收樣（RoboLector Agent觸發(fā)SPAN-8操作）；
系統(tǒng)支持并行篩選48組非補(bǔ)料或32組補(bǔ)料條件，并通過質(zhì)譜（如SCIEX）實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物定量分析，突破傳統(tǒng)工藝開發(fā)的通量瓶頸。
該平臺兼具在線監(jiān)測（Biomass/pH/DO/熒光）、實(shí)時(shí)在線補(bǔ)料及pH調(diào)控與設(shè)備擴(kuò)展性（可聯(lián)用SCIEX質(zhì)譜/MD Reader等），為菌株篩選與工藝優(yōu)化提供閉環(huán)解決方案。研究證實(shí)，通過微流控補(bǔ)料策略與代謝調(diào)控協(xié)同，可優(yōu)化篩選得到最適的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量培養(yǎng)條件，為自動(dòng)化生物制造提供解決途徑。
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