從 Transwell 到器官芯片系統中細胞培養基中銅離子的陽極溶出伏安法測定（2023年8月）

可靠 | 穩定 | 高效 | 創新   

享受絲滑生活 

將傳感裝置集成到細胞培養系統中是實時研究病理學和復雜生物機制的一個熱門話題。特別是被稱為器官芯片（Organ-on-Chip，OoC）的專用微流控裝置，其承載著模擬體內環境的活體工程器官，從傳感器的集成中獲益良多，這使得能夠監測與生物過程相關的特定化學物理參數。在此背景下，銅是一種必需的微量元素，其總濃度可能與特定疾病相關，因此在細胞系統中開發可靠的分析技術至關重要。銅可以通過陽極溶出伏安法（ASV）技術測定，但其在細胞培養基中的應用存在諸多挑戰。因此，在這項工作中，評估了 ASV 在細胞培養基中的性能，并測試了一種酸化方案以提高伏安信號強度。使用 Transwell? 培養模型和 CaCO2 細胞進行離線測量，以測試所開發的酸化方案在細胞培養基中的適用性。最后，設計了一種微流控裝置，以實現細胞培養基酸化的自動化操作，并將其與硅微電極集成，以進行原位測量。由此產生的傳感器集成微流控芯片可用于監測器官芯片模型中銅或其他離子的濃度；這些功能為在接近體內條件下對生物系統進行非破壞性戰略實驗提供了巨大機會。

體外模型在醫學和生物學領域是一種非常重要的研究工具，因為它們能夠揭示細胞的行為，并可用于研究病理學和復雜的生物機制。特別是器官芯片（OoC）代表了體外系統的最新發展，其中細胞在具有傳感功能的微流控芯片中培養，以模擬器官的功能和（病理）生理反應，并監測特定的化學物理參數。微量營養素，如過渡金屬離子鋅、銅和鐵，對生命至關重要，因為它們是多種蛋白質和酶的輔助因子；另一方面，金屬過量會導致自由基的形成，從而在體內引發毒性。因此，所有生物都發展出了復雜的機制來精細調節離子水平，以確保細胞內和細胞外的穩態。旨在提供生理相關結果的微生理平臺，若能采用快速且原位的技術來測量微量營養素的濃度，同時模擬生物系統，將會受益匪淺。

銅是一種對我們的生存至關重要的微量礦物質，存在于人體的所有組織中。銅在紅細胞生成、神經細胞和免疫系統的維持方面發揮著關鍵作用；它對膠原蛋白的形成和能量的產生也很重要。銅含量失衡可能與某些疾病有關，如門克斯病、威爾遜病和阿爾茨海默病；此外，銅含量過低還可能導致心血管疾病。銅從飲食中吸收，其在腸道中的管理和調節對于維持全身銅的平衡至關重要。

飲食中的銅主要以 Cu2+ 的形式存在，會被還原（可能以 Cu+ 的形式），然后被腸上皮細胞吸收。最近的證據表明，具有兩個銅結合位點（一個結合 Cu2+，一個結合 Cu+）的腸黏蛋白糖蛋白參與保護細胞免受過量銅毒性的侵害，通過阻止不必要的氧化還原循環并控制生理過程所需的低水平銅攝取。盡管腸道銅吸收的調節至關重要，但目前對其涉及的機制了解甚少。因此，對細胞培養基中 Cu2+ 濃度進行實時監測可能是研究銅轉運和攝取過程的重要工具。

測定銅的典型分析技術有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發射光譜法和電感耦合等離子體質譜法。這些分析技術非常靈敏，但需要使用笨重且昂貴的儀器設備。此外，這些技術需要一個重要的準備階段，使用強酸性物質、高溫和/或高壓。作為替代方案，光學方法具有高度靈敏、選擇性好、成本低且易于應用的優點。在這些系統中，識別元件（光學探針）與目標物質之間的相互作用可以引起光學特性的變化。有時，光學探針與目標分析物之間的相互作用可能會導致有毒物質的形成，當在細胞環境中進行檢測時，這一點必須深入評估。此外，在細胞培養基等復雜介質中使用光學方法時，其他有機物質的存在可能會干擾光學活性物質的形成。由于這些原因，使用光學方法并非總是最佳選擇。

在這種情況下，電化學方法成本低、操作簡便且速度快，因此適用于原位和在線分析。特別是陽極溶出伏安法（ASV）是一種檢測包括銅在內的重金屬的非常通用的技術。這種分析技術基于兩步檢測。第一步是在工作電極表面通過施加負電位（根據Pourbaix圖）將銅離子沉積/還原。在第二步中，從沉積時的電位開始進行電位掃描，直至電位足以使離子再次被氧化并從工作電極表面“溶出”。溶出過程對應于伏安圖中出現的峰，其電流強度與離子濃度成正比（定量分析），而峰電位則特定于被分析物（定性分析）。

在細胞培養基中，電化學技術已被用于監測各種小分子，如葡萄糖、乳酸、氨基酸、藥物等，然而通過伏安法檢測痕量金屬的例子卻寥寥無幾。細胞培養基中大量有機物質的存在，給使用差分脈沖伏安法技術獲取可靠且強烈的信號帶來了挑戰。

為了將這種分析技術整合到體外系統中以實現離子的實時監測，我們評估了不同細胞培養基中安培溶出伏安法（ASV）的性能，并設計并測試了一種培養基酸化方案，以增強伏安信號并降低檢測限。我們團隊此前已通過機器學習方法證明了其提高檢測靈敏度的潛力。

首先，這種分析和預處理方法的潛力被應用于通過從上室和下室抽取細胞培養基來監測 Caco-2 細胞 Transwell? 培養模型中的銅濃度。然后，通過采用帶有微流控控制器/傳感器的商用芯片設計了一個微流控回路，以自動調節細胞培養基和酸化溶液的流量，從而實現自動酸化方案。此外，還在微流控回路中集成了一個微電極，以便在原位進行陽極溶出伏安法測量。

所報告的結果代表了將化學傳感器集成到復雜器官芯片系統中的重要一步。事實上，據我們所知，目前還沒有將交流伏安法分析技術與自動化樣品處理相結合的器官芯片設備；這一方面對于評估此類復雜系統的性能至關重要。

圖 1. 集成于微流控芯片中的電化學傳感器，（a）微加工工藝示意圖；（b）準備進行校準和實驗測試的最終裝置。

圖 1b 展示了最終集成有三個電極的傳感器圖像，已準備好進行校準和實驗測試。

圖 2. 在 pH 值為 7.4 的條件下，采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定（a）MEM；（b）DMEM；（c）F12K；（d）MEM+ 中銅的含量。在 pH 值為 7.4 的 MEM、DMEM 和 F12K 中陽極溶出伏安法的校準曲線（e）。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 3. 在 pH 值為 4 的條件下，采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定（a）MEM 中銅的含量；（b）DMEM 中銅的含量；（c）F12K 中銅的含量；（d）MEM+ 中銅的含量。在 pH 值為 4 的 MEM、DMEM、F12K 和 MEM+ 中陽極溶出伏安法的校準曲線（e）。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 4. 采用三電極裝置的陽極溶出伏安法測定 Caco-2 細胞 Transwell? 培養模型中銅的含量：監測時間分別為 0 小時和 72 小時，（a）10 μM Cu2+—生理 pH 值；（b）20 μM Cu2+—生理 pH 值；（c）10 μM Cu2+—酸性 pH 值；（d）20 μM Cu2+—酸性 pH 值。累積電位：相對于 Ag/AgCl 為 -0.4 V；累積時間：30 秒；溶出掃描：-0.4 V 至 0.7 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz，E 步長 4 mV）。

圖 5. 采用表 1 中所列四種情況的商用平臺改造后的傳感室中可實現的混合時間和效率。

圖 6. 有限元分析得出的穩態濃度分布，其中（a）ME = 99%，（b）ME = 81%。

圖 7. 集成離子傳感器的微流控芯片照片（a）；在芯片（檢測室）中使用三電極集成傳感器（微電極）進行銅測定的陽極溶出伏安法（累積電位：相對于 Pt 的 -1.0 V；累積時間：100 秒；溶出掃描：-1.0 V 至 0.3 V（方波伏安法：脈沖幅度 30 mV，頻率 25 Hz 和 E 步長 4 mV）（b）；芯片（檢測室）中的校準曲線（c）。

在細胞環境中檢測和監測銅對于不同的生物學研究具有重要意義，有助于了解其在分子途徑中的作用、在體內的調節機制以及與特定疾病的關系。特別是銅可通過飲食提供，并由腸上皮細胞吸收，從而維持全身的銅穩態。盡管腸上皮細胞在銅的調節中起著重要作用，但其相關機制尚未完全闡明。通過將傳感器與細胞系統相結合，并模擬接近體內條件的環境，可以研究此類機制。

基于上述背景，本研究對不同細胞培養基中銅離子的電化學傳感進行了探究。在生理條件下（pH 7.4）進行陽極溶出伏安法檢測時，在（亞）生理濃度的離子下觀察到中等強度的電流信號。設計并測試了一種細胞培養基酸化方案，以增強伏安峰并提高系統的響應性，結果觀察到系統響應性更高。事實上，酸化過程能夠促使培養基中存在的有機物質與銅離子解離，從而增加可用電位溶出伏安法（ASV）技術測量的離子數量，進而估算培養基中銅的總量。該酸化和檢測方案在體外系統中進行了測試，通過使用 Caco-2 細胞 Transwell? 培養模型進行測量。特別是，為了間接估算細胞吸收的銅離子量，可以隨時間監測上室和下室培養基中的銅含量。腸道屏障僅能吸收生理濃度的銅，防止吸收過量的銅，因為過量的銅是有毒的。因此，通過量化培養基中的離子，可以提供細胞吸收量和腸道屏障完整性的信息。將這種檢測方案整合到器官芯片系統中，可以實現銅攝取和調節機制的自動監測，還可以通過這種傳感系統與生化實驗的相關性方法進行研究。因此，采用嵌入式集成微傳感器實現了用于酸化過程和銅檢測的微流控裝置，并對其進行了研究。有限元分析模擬確定了在經過改造的商用微流控平臺上實現介質酸化所需的最佳注入條件，且在可接受的混合時間內達到預期效果。

參考文獻：

Prontera, C.T.; Sciurti, E.; De Pascali, C.; Giampetruzzi, L.; Biscaglia, F.; Blasi, L.; Esposito, V.; Casino, F.; Siciliano, P.A.; Francioso, L.N. Anodic Stripping Voltammetric Determination of Copper Ions in Cell Culture Media: From Transwell? to Organ-on-Chip Systems. Chemosensors 2023, 11, 466.

掃描關注微信公眾號，隨時了解更新信息！

掃描關注，隨時溝通。