新品應用 | 寡核苷酸熱穩定性的快速篩選創新方案

短期熱穩定性測試對于保障寡核苷酸類藥物產品質量并支持注冊備案至關重要。TA 儀器創新的RS-DSC快速篩選差示掃描量熱儀是一款測量寡核苷酸(oligos)熱穩定性的有效工具，可用來評估其熱穩定性與不同緩沖液成分、寡核苷酸濃度及鏈長的相關性。

引言

TA儀器經典的Nano DSC差示掃描量熱儀是一款用于監測中短鏈寡核苷酸在低濃度下熱穩定性的成熟工具^[1,2]。其毛細管樣品池的靈敏度更高，但在低濃度(<1mg/mL)下測定的寡核苷酸穩定性可能無法充分反映生物治療制劑在更高配方濃度下的穩定性。而近年新推出的RS-DSC快速篩選差示掃描量熱儀則搭載突破性的微量熱技術，可直接使用低體積、高配方濃度樣品進行大分子熱穩定性篩選，無需樣品稀釋和清洗。

寡核苷酸藥物(ONs)是一種新興藥物類別，旨在通過調節基因表達來治療疾病^[3,4]。最常見的ONs藥物包括反義寡核苷酸(ASOs)和小干擾RNA(siRNA)藥物。盡管ASO和siRNA類藥物通過不同機制發揮，但二者均通過Watson-Crick堿基配對與靶向RNA結合來激活或基因表達。熔解溫度(T_m)指一半DNA分子雙鏈結構解離為單鏈時的溫度，是設計寡核苷酸藥物序列的關鍵參數。研究表明，許多DNA結合藥物的其復合物的熱力學特性密切相關^[5]。

差示掃描量熱分析(DSC)是一種用來獲取核酸、修飾核酸及核酸-配體相互作用熱力學特性的寶貴工具(圖1)。除了直接測量核酸復合物的熔解溫度外，它還能直接測量熱焓(ΔHcal)，理解吉布斯自由能變化(ΔG)和熵變(ΔS)。通過DSC技術，可清晰闡明核苷酸鏈長度、核苷酸濃度以及配方條件(包括緩沖液、賦形劑、pH值和離子強度)的影響。

圖1：通過差示掃描量熱分析獲得的DNA變性曲線示意圖。在變性(熔解)前，寡核苷酸保持其經典雙螺旋結構；當溫度升高時，其結構轉變為單鏈盤繞形式。

對兩種市售ASO藥物的衍生物進行了評估。EXONDYS 51™ Eteplirsen是一種長度為30個核苷酸的磷酰二胺嗎啉代反義寡核苷酸，于2016年獲批用于治療杜氏肌營養不良癥。該反義寡核苷酸制劑濃度為50mg/mL，通過靜脈輸注給藥^[6]。

TEGSEDI™ Inotersen是一種長度為20個核苷酸、具有gapmer結構的反義寡核苷酸，獲批用于治療遺傳性轉甲狀腺素蛋白介導的淀粉樣變性(hATTR)患者的多發性神經病變。其制劑濃度為200mg/mL，每周皮下注射給藥^[7]。

實驗方法

為進行量熱分析，將11μL寡核苷酸樣品直接移入一次性玻璃微流控芯片(MFC)中加樣后，使用玻璃蓋片密封微流控芯片，確保樣品在加熱至100°C的過程中保持完好。將密封好的微流控芯片置于RS-DSC的樣品側。將一個可重復使用的聚醚醚酮(PEEK)芯片置于參考側。該量熱儀可在20-100°C溫度范圍內，以1或2°C/min的預設掃描速率同時處理多達24個樣品。采用一次性微流控芯片，一個工作日通常可完成多達96份樣品的檢測。

通過TA儀器RSDSCRun軟件操作TA儀器RS-DSC，每次掃描開始前在初始溫度下平衡30分鐘。在20-100°C的溫度范圍內，以1或2°C/min的速率掃描每個樣品。使用NanoAnalyze™軟件(4.1.0版)處理數據。自動檢測差示掃描量熱圖中的基線、T_max和T_onset參數軟件可導出自動分析生成的表格數據用于輕松對比。

結果與討論

不同濃度寡核苷酸的篩選

熱穩定性是寡核苷酸藥物產品的一項關鍵質量屬性，受鏈長、G:C含量、濃度及其緩沖體系的離子強度影響^[8]。差示掃描量熱儀(DSC)是表征生物分子熱力學特征的工具。而RS-DSC兼顧通量濃度適應性，可實現制劑濃度下寡核苷酸候選藥物的快速篩選。

對獲批ASO藥物inotersen和eteplirsen的天然DNA類似物在不同濃度下進行了三次重復數據分析。本研究篩選的濃度最高約為70mg/mL，而某些獲批核酸療法制劑濃度可達200mg/mL^[4]。RS-DSC采用一次性微流控樣品芯片，專為容納此類高濃度制劑而設計，支持直接對未稀釋藥物進行熱穩定性測試。

圖2：A) 20堿基對DNA雙鏈體與B) 30堿基對DNA雙鏈體在Gibco DPBS(pH7.4)緩沖液中不同稀釋度下的曲線疊加圖

寡核苷酸的熔解溫度對應50%的螺旋雙鏈體分離為單鏈盤繞構象時的溫度。Inotersen類似物為20堿基對的DNA鏈，GC含量為40%。在各濃度下熔解溫度均表現出優異的重現性，且濃度與Tm值之間存在顯著正相關性——當濃度從1.4 mg/mL增加至72mg/mL時，熔解溫度偏移超過7°C(圖2A)。同樣，eteplirsen類似物為30堿基對的互補DNA鏈，GC含量為43%。其熔解溫度亦隨濃度變化而變化，從1.4mg/mL時的76.79°C到72mg/mL時的81.70°C(圖2B)。兩種寡核苷酸三次重復實驗的平均T_max值及標準偏差見表1。

表1：20及30堿基對雙鏈體濃度篩選的轉變溫度平均值±標準差，n=3

配方緩沖液篩選

PCR經驗表明，在引物選擇中，隨著陽離子鹽濃度的增加，寡核苷酸的熱穩定性會隨之提高^[9]。在通常情況下，鹽濃度升高會導致寡核苷酸熔解溫度(T_m)升高；但每個序列和結構都具有獨特性，因此需要通過DSC進行進一步測試。當測試濃度為10、20和40mg/mL時，在磷酸鹽緩沖液中添加75或150mM NaCl后，eteplirsen類似物的熱穩定性得到增強(圖3)。插圖中的范特霍夫曲線清晰顯示：未添加NaCl的樣品，其濃度依賴性遠高于75mM或150mM NaCl處理組。各樣品條件下的平均熔解溫度(T_m)與熔解起始溫度(T_onset)詳見表2。

圖3：增加氯化鈉濃度可提高30堿基對DNA雙鏈體的熱穩定性。緩沖液成分：10mM磷酸鈉，0-150mM氯化鈉，pH 7.0。數據以1°C/分鐘的掃描速率進行三次實驗測得。

表2：30堿基對雙鏈體濃度篩選的峰值轉變溫度(_{Tmax)和起始溫度(Tonset)}平均值±標準差，n=4

etepliresen類似物的熱穩定性不受pH值影響(圖4和表3)，在整個pH值范圍內均保持一致。

圖4. 在pH值7.0-7.5范圍內30堿基對雙鏈體熔解的熱穩定性保持不變。緩沖液成分：10mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH 7.0-7.75。數據以1℃/分鐘的掃描速率進行三次實驗測得。

表3：30堿基對雙鏈體濃度篩選的_{峰值轉變溫度(Tmax)和起始溫度(Tonset)}平均值±標準差，n=4

結論

篩選溶液環境和序列修飾對短期熱穩定性的影響對開發高質量的寡核苷酸至關重要。TA儀器RS-DSC可通過在制劑濃度下同時測試多達24個樣本實現熱穩定性的高通量篩選。本文展示了如何對雙鏈體DNA寡核苷酸進行精確且可重復的分析，并快速測定緩沖液成分對整體熱穩定性的影響，然后利用數據處理軟件NanoAnalyze的新算法對高通量篩選中產生的大量熱力學數據進行高效分析。總之，TA儀器RS-DSC為表征寡核苷酸的熱穩定性提供了全新平臺，為確保產品質量和支持注冊備案提供了重要手段。