賽多利斯集團：非標記技術在藥物早期發現中的應用

大多數小分子藥物和生物藥(包括單克隆抗體)可以作用于治療靶點，從而改變其功能。藥物開發的前提是通過對這些靶點的鑒別，通常是蛋白質或核酸，明確它們在疾病中所起到的因果作用以及具有一定的“成藥性”，例如藥物有適當的藥理作用1。藥物開發過程往往是耗時長，風險高且花費巨大。一種新藥從發現到被批準上市，盡管精確的時間表各不相同，但通常需要10年以上的時間2。此外，在每年開發的許多候選藥物中，只有很少一部分能夠獲得監管機構的批準進入臨床試驗研究。篩選靶點特異性結合的候選藥物，驗證與靶點的相互作用，需要多種工藝和表征技術，而這些工藝和表征技術的局限性又是藥物研發耗時冗長的諸多原因之一。具備實時分析和高通量性能的現代分析技術大大縮短了藥物研發時間，并運用簡化的方式選擇最佳候選藥物，為下游開發的成功提供了最佳機會。

傳統的分析技術，例如基于熒光的方法，都需要對分析物或二抗分子標記上熒光信號。標記位點通常不具備特異性，因此可能會導致結構改變，從而影響其活性。需要標記的分析方法往往包含多個特定的步驟，每個步驟都需要進行優化，最終導致研發時間的增加。此外，由于熒光標記的干擾而產生的假陽性結果可能對數據質量產生不利影響。近20年來，非標記分析技術在藥物早期發現中展現出明顯的優勢。由于不需要標記試劑，非標記分析平臺能夠大幅加快實驗開發過程。非標記技術在藥物發現中的關鍵應用包括通過平衡解離常數(KD)，結合速率常數(ka)，解離速率常數(kd)等動力學參數，評估結合藥物與靶點的結合活性。圖1展示了藥物早期發現階段常規工作流程中的關鍵步驟。

測定平衡親和常數和動力學速率常數，是識別目標分子、選擇和優化先導藥物的關鍵過程。這些參數使研究人員能夠更好地了解候選藥物對其靶點的潛在作用機制（MOA），并為選擇最佳候選治療藥物提供信息，從而推進整個開發周期。除了新先導藥物分子外，在將生物類似藥物分子與其對應的原研藥物進行比較時，動力學特征也非常關鍵。對于生物類似藥而言，其產品質量屬性的評估至關重要，尤其是通過研究配體結合的功能等效性評估，為患者在類似臨床安全性和有效性方面提供重要信心。一般來說，通常使用純化的樣品對先導藥物分子進行全面的表征，然而，在篩選實驗中的解離速率排序和先導藥物分子的選擇時，可以使用未純化的樣品進行。對于開發抗體類藥物，在分類和選擇最佳抗體克隆時，也需要進行表位分組等其他表征實驗。

在表征功能性質時，生物分子間相互作用的動力學分析尤其重要，是研發和生產過程中必不可缺的分析步驟。人們傳統上使用像ELISA這樣的終點法來描述結合相互作用。然而，ELISA有許多缺點，包括不能解析結合和解離動力學特性。例如，相同的穩態結合親和力可能源于截然不同的動力學，科學家在選擇先導藥物的過程中可以依據這些信息做出決策（圖2）。此外，由于ELISA實驗方案中包含許多清洗步驟，弱相互作用可能難以被監測到。另一方面，高通量非標記技術為動力學測量提供了獨特的見解。這些技術提供了動力學細節，例如結合（ka）和解離（kd）速率，該速率信息可為相互作用機制提供更多的信息。此外還有親和力常數（KD），該常數可以衡量配體與其分析物之間結合的緊密程度。這是指標可以很好的在開發過程中指導藥物療效所需的濃度。

雖然在藥物研發中仍然會使用諸如ELISA和Western Blots等傳統生化分析方法，但是越來越多的科學家在他們的工作流程中開始采用非標記分析技術。基于這些技術的系統可以將生物分子間的相互作用轉化為響應信號（通常是實時信號），為研究人員提供研究表征結合機制的工具。除此之外，這些系統可用于動力學表征、濃度測定和生物分子相互作用篩選等。非標記技術可在動力學表征實驗中提供結合/解離速率信息，這是和親和力常數息息相關的重要因素，也是終點法分析技術（如ELISA）所無法提供的。常用的非標記技術有：等溫滴定量熱技術（ITC）、表面等離子共振技術（SPR）和生物層干涉技術（BLI），每種技術都有其獨特的優點。面對如此多的選擇，研究人員應用所需的技術，在藥物研發過程的各個階段推動候選藥物快速準確地進行。在這些常用的非標記技術中，ITC所提供的豐富的熱力學數據具有廣泛的用途；但在相互作用研究中，ITC無法提供動力學信息，如ka和kd值。SPR和BLI雖然無法獲取豐富的熱力學數據，但它們都可提供帶有豐富信息的親和力表征數據，例如ka和kd值（請在此處閱讀有關非標記技術的更多信息）。基于BLI技術的Octet^?平臺具有獨特的優勢，使其成為加速藥物早期發現的理想技術。

Octet^?平臺采用96孔或384孔樣品板，儀器的讀取探頭可直接移動到樣品板中。與SPR技術明顯不同的是， Octet采用非流路設計，可以更好的耐受不同樣品的基質。與SPR儀器相比，Octet^?系統也相對易于使用，其對使用者的操作和分析技能要求相對更低，并且不需要在樣品裝載或樣品運行時的清洗環節上浪費大量時間。這些特性，加上其一次可同時分析多達96個樣品（Octet^?  RH96）的能力，使得Octet^?成為藥物早期發現階段中理想的先導藥物選擇系統。

Octet^?系統用于藥物早期發現的優勢：

-無流路；不堵塞樣品，系統可兼容多種類型的粗樣品

-易于使用，用途廣泛；與其他技術相比，使用者的技能門檻較低

-高通量；能夠快速篩選主要生物制藥的靶點

-低維護；與SPR技術相比，維護時間大幅減少

新治療藥物的發現始于靶標識別；即識別與疾病病理生理學相關的生物學靶點的過程4。非標記實驗可以監測不同類型的生物分子之間的相互作用，包括蛋白質、DNA/RNA、抗體、病毒和細胞。現有豐富的人類遺傳信息可用于識別藥物靶點、驗證治療方案并預測針對分子靶點的抑制性化合物的潛在安全性。一旦確定了靶點，下一步就是開發一個分子庫來篩選有希望的先導候選藥物。這個過程通常包括篩選數以萬計的小分子或生物藥，用以確定可與細胞疾病的靶點蛋白相結合并引起變化的少數最佳候選藥物（通常3-5個）。

在藥物發現項目中，基于片段的藥物發現（FBDD）是一個用于識別小分子候選藥物的熱門平臺。片段結合可以使用靈敏的生物物理技術來檢測和表征，該技術能夠檢測小分子化合物的弱親和力相互作用。諸如核磁共振（NMR）、X射線晶體衍射、差示掃描熒光法（DSF）、SPR和BLI等技術是許多制藥和生物技術實驗室用于識別目標靶點的核心技術。然而，片段篩選往往受到樣品量大、分子量低（<300 Da）、親和力弱（KD=10 μM-10 mM）和溶解度低等諸多限制。微弱的親和力和有限的溶解度就需要使用高于相互作用KD值的樣品濃度來測試結合，但這個條件往往又不切實際，并且經常導致最終做出決策是基于不適當的實驗設置條件。Pioneer FE是新一代的SPR儀器，可憑借其獨有的一步進樣（OneStep）功能做出更好的決策5。OneStep進樣功能可通過在進樣管道中生成樣品或分析物的梯度濃度來增加樣品通量和數據信息量，從而顯著改善基于SPR技術的片段篩選。Pioneer FE旨在通過在單次樣品進樣中測試全濃度梯度來簡化結合分析。這不僅節省了樣品制備時間和材料，而且免除了制備多濃度樣品稀釋液的需求，也減少人為誤差。OneStep進樣功能還通過簡化工作流程的效率，顯著改善SPR生物傳感器芯片檢測的運作方式（在此處了解更多信息）。當候選片段選擇在初步篩選過程中就完成優化，則完全沒有必要再進行二次篩選（圖3和圖4）。

在選擇具有最佳藥物特性的候選藥物時，通常要對靶向特異性、可生產性和可開發性等指標對生物制藥候選庫（如雜交瘤或噬菌體展示）開展篩選。篩選工作通常從分析主要目標靶點的結合開始，然后再進行動力學表征。必須在發現過程的早期就把那些靶點結合親和力較弱、靶點選擇性低、生化或生物物理特性差的不良苗頭藥物都剔除掉。然而，如果需要在分析前對大量的雜交瘤或噬菌體展示樣品進行純化，那么先導藥物的選擇和優化就會成為一個瓶頸問題。由于非特異性結合高和檢測分辨率低，大多數分析技術無法在粗樣品中實現準確的測量。由于粗樣品通常會導致微流路管道的堵塞，因此與使用微流路設計的系統相比，應用非標記技術（如Octet^?) 的系統是分析這些類型樣品的理想選擇。

生物制藥通常都是大分子，需要具有高通量能力的技術來同時快速篩選多個樣品。更關鍵的是能夠在其原液中直接篩選出這些分子，從而節省純化樣品所需的時間和資源。

雜交瘤是由抗原免疫小鼠的脾 臟B細胞和骨 髓瘤細胞系融合而成。雜交瘤是產生抗體的克隆細胞系，可被用于抗原特異性結合的篩選。迄今為止，有一半以上的商業化抗體藥物來自雜交瘤細胞系，并且雜交瘤已被用于生產雙特異性單克隆抗體。在開發單克隆抗體療法時，篩選融合雜交瘤以及亞克隆候選雜交瘤，是一個非常耗時的步驟。這一挑戰不僅體現于先導藥物在基于體內療效和表位作圖的選擇，也體現于先導藥物優化過程中的人源化、親和力成熟、藥物安全性研究和生物標記物開發等方面。傳統上，在將雜交瘤細胞轉移到多孔分析板之前，需要使用細胞分選法將雜交瘤分離成單個細胞，然后使用單點結合實驗篩選雜交瘤上清液，用以評估抗原結合。之后可以分離一部分陽性克隆用以抗體鑒別，這些抗體將被表達和純化，以作進一步的表征。因此，篩選雜交瘤上清液用于抗原結合抗體是發現過程中的關鍵步驟。高通量技術可以大幅縮短選擇最佳抗體的時間，有效促進這一過程。

雖然ELISA已被用于篩選先導藥物，但在應用ELISA對抗體進行抗體庫篩選時，無法根據靶點開展排序。Octet^? 系統可識別具有高親和力和低解離速率的克隆，以便進一步表征。目前解離速率分析非常流行，因為無需知道抗體濃度就能對粗樣品實現快速篩選和評估，如細菌裂解液等（圖5）。與非標記技術（如Octet^? 系統）一起使用時，該過程只需簡單地將目標抗原固定在生物傳感器表面，然后將生物傳感器浸入樣品庫中，從而監測抗原和抗體的解離。與親和力較低的候選先導藥物相比，結合力強的候選先導藥物會表現出較慢的解離速率。

特定抗體的基因序列通常被整合到絲狀噬菌體的DNA序列中。噬菌體在其衣殼表面表達單鏈抗體scFv，通過感染大腸桿菌并利用其復制系統連續展示新噬菌體，這導致了大量scFv的快速生成7。此外，噬菌體淘選是一種將噬菌體展示與所需靶標結合的過程，可以用多個抗原按順序進行，以富集靶向保守表位的抗體8。雜交瘤與噬菌體展示技術存在根本性的差異。與雜交瘤技術相比，噬菌體展示技術被認為更為通用、強大且快速。它也被廣泛應用于體外方法，使得候選藥物的親和力成熟更容易控制。利用這兩種技術都可以進行解離速率排序，以便加快先導藥物的選擇過程。

雜交瘤和噬菌體展示方法旨在針對每個靶點產生大量抗體。根據結合靶點表位的相似性，這些抗體通常需要歸類到不同的“組”中，因為相似的表位會表現為相似的功能。因此，表位分組是一種被廣泛應用的先導藥物選擇技術。在這一過程中，單克隆抗體以成對的方式或組合的方式相互競爭，以便與特定抗原結合。表位組是指在被測試的單克隆抗體組中代表的單個表位。因此，如果兩個單克隆抗體具有相同的阻斷效應，則它們同屬于一個組。由于用計算機預測B細胞表位極具挑戰，表位分組技術仍然是一個依賴經驗的過程6，其中非標記分析技術發揮著至關重要的作用。表位分組主要使用三種形式（圖6）；預混法、夾心法、以及串聯法。在這三種方法中，最常用的是傳統的夾心分析法，即將一種抗體固定在固體表面（生物傳感器或芯片表面），然后結合上目標分子（抗原），最后通過檢測第二個抗體組的結合來進行篩選。串聯法也很常見，該方法是首先固定抗原，然后結合第一個抗體，再篩選另一組抗體。預混法使用較少，主要是因為預混合的樣品之間需要較高的比率，這使得該方法的成本相對更高。所有這些方法的目的都是通過評估每個連續結合步驟，并根據結合圖譜的相似性將篩選出的抗體進行分組。雖然有許多非標記技術能夠進行表位分組，但考慮到需要篩選的候選物數量，高通量儀器往往更適合這種應用。由于經常需要嘗試使用多種方法，特別是當一種方法的結合響應不甚明確時，像Octet^?  RH96這樣的系統無疑是一個最理想的選擇。它具有前所未有的高通量，并可以靈活的運行所有三種分析方法。

雖然目前開發的大多數新型生物藥仍集中在單克隆抗體上，但越來越多的更具療效潛力的新型分子正在獲得人們的關注。這些分子包括雙特異性和三特異性抗體、抗體藥物偶聯物和細胞療法。雙特異性抗體（bsAb）由Nisonoff和Rivers于1961年首次報道，且越來越受歡迎。迄今為止，市場上有兩種雙特異性抗體藥物（博納吐單抗和艾美賽珠單抗），另有85多種正在臨床開發中。由于bsAb是由多種不同成分組成，包括多種不同的形式（包括以對稱或不對稱的方式對抗體片段進行各種組裝），因此在研發過程中對bsAb的功能評估是至關重要且具有挑戰性。靶向組裝的雙特異性通常在細胞內共同產生；有一些是構象不同，而另一些則可能包含兩個預定結合表位的部分。因此，研究人員迫切需要簡單的方法，以便在功能上評估兩種或兩種以上的復合雙特異性治療方法。ELISA和SPR是目前最常用的bsAb評估方法；但這兩種方法都耗時較長。最近的研究表明Octet^? 系統對于功能評估和效價測定可能是一種更好更快的方法，例如在藥物早期發現過程中開展高質量的候選克隆選擇。如果僅通過滴度進行篩選時，大量高質量候選克隆可能會被淘汰。高通量Octet^?  RH96系統的最新研究9展示了一種結合效價測定和功能評估的方法，用以對各組bsAb的進行抗原檢測，從而識別具有特異性抗原結合的高濃度的pool和克隆。這項研究需要將特定抗原固定到生物傳感器表面，然后通過評估對固定化抗原的結合反應來篩選各種克隆（圖7）。該測定方法可與蛋白A結合串聯進行，以同時獲取效價信息。