方法介紹：針葉光合作用測定方法

本文由 東莞市譜標(biāo)實驗器材科技有限公司 整理匯編

2014-05-28 00:00 741閱讀次數(shù)

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　　　　　　　　細(xì)胞活性測定方法細(xì)胞活性測定方法有臺盼藍(lán)染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素?fù)饺敕āTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：1.MTT法MTT：化學(xué)名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。2.XTT法XTT：化學(xué)名：2,3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK-8法或稱WST-8法CCK-8試劑中含有WST8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗、細(xì)胞毒性試驗以及藥敏試驗等。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細(xì)胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。三種方法的比較MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需預(yù)制使用有機溶劑DMSO或其它溶劑方便性++++++檢測速度++++++重復(fù)性+++++穩(wěn)定性+++++工作量------對細(xì)胞毒性------對人體毒性-----MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項MTT原理MTT全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。　　缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器**用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT吸光度**在0-0.7范圍內(nèi)。MTT一般**現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，**小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件**帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl8g＋KCl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4，定容1L。普通MTT法實驗步驟：1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2：培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。藥物MTT法實驗步驟貼壁細(xì)胞：1：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2：5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔。建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3：5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6：每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7：同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。懸浮細(xì)胞：1：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋（儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找**稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml1640）2：置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3：每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。注意事項：（1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（3）設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，Z后比色以空白調(diào)零。（4）MTT實驗吸光度Z后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系。（5）用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲顆粒進(jìn)行比色測定。（6）一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲洗掉，然后每孔加150ulDMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。[詳細(xì)]

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  本方法用手測定石油產(chǎn)品經(jīng)蒸發(fā)和熱解后留下的殘?zhí)苛浚蕴峁┦彤a(chǎn)品相對生焦傾向的指標(biāo)。本方法一般用于在常壓蒸餾時易部分分解、相對地不易揮發(fā)的石油產(chǎn)品。對含有能生灰組分的石油產(chǎn)品（用GB508《石油產(chǎn)品灰分測定法》測定）則會得到殘?zhí)恐灯叩慕Y(jié)果，誤差的大小取決于所生成灰分的量。注:①本方法中所用的“殘?zhí)俊币辉~，是指石油產(chǎn)品經(jīng)蒸發(fā)和熱解后所形成的碳質(zhì)殘余物。它不全部是碳。而是一種會進(jìn)一步熱解變化的焦炭。本方法采用“殘?zhí)俊边@個詞，只是順從習(xí)慣的稱法。②本法廣泛應(yīng)用于多種石油產(chǎn)品。本方法和ZBE30001《石油產(chǎn)品殘?zhí)總?cè)定法一（蘭氏法）》這兩種方法所測得的殘?zhí)恐担坏跀?shù)俏上不相同，而且它們之間也找不到滿意的相互關(guān)系。對于一些不容易裝人蘭氏焦化球的重質(zhì)殘渣燃料油、焦化原料等油料.宜用本方法測定殘?zhí)俊Ｈ紵魅剂系臍執(zhí)恐担捎脕泶致缘毓烙嬋剂显谡舭l(fā)式的釜型和套管型燃燒器中形成沉積物的傾向。同樣，不含硝酸戊酯（或如果含有硝酸戊酯，則只要事先測定未加此添加劑基礎(chǔ)燃料）的柴油，殘?zhí)恐荡篌w上與燃燒室的沉積物有對應(yīng)關(guān)系。測定粗柴油的殘?zhí)恐担瑢χ笇?dǎo)粗柴油造氣的生產(chǎn)是有用的，而原油殘渣、汽缸油料和重質(zhì)潤滑油料的殘?zhí)恐担瑢χ笇?dǎo)潤滑油生產(chǎn)也是有用的。下述情況應(yīng)予注意:a.發(fā)動機油：發(fā)動機油的殘?zhí)恐担欢缺徽J(rèn)為能表示發(fā)動機油在發(fā)動機的燃燒室中生成碳質(zhì)沉積物量的指標(biāo)，但由于許多石油產(chǎn)品中都存在添加劑，所以現(xiàn)在看來這一點是值得懷疑的。例如，有灰分生成的清凈添加劑，會增加石油產(chǎn)品的殘?zhí)恐担ǔ？梢詼p少石油產(chǎn)品生成沉積物的傾向。b.柴油:含有硝酸戊酯的柴油的殘?zhí)恐灯摺５牵绻麑Σ缓跛嵛祯サ牟裼停驅(qū)?zhǔn)備要調(diào)人硝酸戊脂的基礎(chǔ)燃料進(jìn)行試驗，則其殘?zhí)恐蹬c燃燒室沉積物有近似的關(guān)系。c.含有有灰分生成的添加劑的石油產(chǎn)品:殘?zhí)恐悼赡芘c形成沉積物的傾向無關(guān)，而日可能比形成沉積物的相應(yīng)傾向要高些。本方法參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)ISO6615-1983《右油產(chǎn)品殘?zhí)繙y定法（康氏法）》。方法概要把已稱重的試樣置于坩堝內(nèi)進(jìn)行分解蒸餾。殘余物經(jīng)強烈加熱一定時間即進(jìn)行裂化和焦化反應(yīng)。在規(guī)定的加熱時間結(jié)束后，將盛有碳質(zhì)殘余物的坩堝置于干燥器內(nèi)冷卻并稱重，計算殘?zhí)恐担ㄒ栽嚇拥馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示）。相關(guān)檢測儀器：YT-268康氏殘?zhí)繙y定儀康氏殘?zhí)繙y定儀[詳細(xì)]

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• 氯化鋰的生產(chǎn)方法介紹

  氯化鋰，無機化合物，無色立方晶體，具有潮解性。味咸。易溶于水，乙醇、、丙酮、吡啶等有機溶劑。屬低毒類。對眼睛和粘膜具有強烈的刺激和腐蝕作用。氯化鋰主要用于空氣調(diào)節(jié)領(lǐng)域，用作助焊劑、干燥劑、化學(xué)試劑，并用于制焰火、干電池和金屬鋰等。氯化鋰屬低毒類。對眼睛和粘膜具有強烈的刺激和腐蝕作用。中毒主要由于誤服，病人出現(xiàn)全身，無力、眩暈、耳鳴、視力模糊、口干、食欲減退、惡心、嘔吐或腹瀉。重者出現(xiàn)抽搐、昏迷，有時可呈現(xiàn)精神障礙。氯化鋰主要用于化工、醫(yī)藥、催化劑、有機化學(xué)等行業(yè)。用于空氣調(diào)節(jié)，用作助焊劑、干燥劑、化學(xué)試劑，并用于制焰火、干電池和金屬鋰等。氯化鋰若發(fā)生泄露隔離泄漏污染區(qū)，周圍設(shè)警告標(biāo)志，建議應(yīng)急處理人員戴好防毒面具，穿化學(xué)防護(hù)服。小心掃起，裝入備用袋中。也可以用大量水沖洗，經(jīng)稀釋的污水放入廢水系統(tǒng)。如大量泄漏，收集回收或無害處理后廢棄。氯化鋰的生產(chǎn)制備方法是：蒸發(fā)LiCl水溶液可得LiClH2O結(jié)晶，高于98℃可得無水鹽，但加熱至結(jié)晶水脫盡前即同時水解失去部分HCl，而使產(chǎn)物呈堿性。純無水LiCl（水溶液的pH=6~7）需要用減壓脫水，與NH4Cl共熱，在干燥HCl氣流中加熱至200℃或無氧條件下用純氮噴霧干燥制得。LiClH2O或無水鹽在空氣中均極易吸濕而至水滴狀。無水LiCl主要用于電解制備金屬鋰、鋁的焊劑和釬劑及非冷凍型空調(diào)機中的吸濕（脫濕）劑。工業(yè)上主要由鋰云母、鋰輝石以及提取NaCl、KCl后的鹽鹵水中提取。通常使用的是由Li2CO3或LiOH與鹽酸作用制得。一些試劑廠生產(chǎn)的無水LiCl往往是在蒸發(fā)LiCl水溶液至100-110℃時熱濾而得的塊狀體，其含水量在3%-5%。[詳細(xì)]

  2018-09-27 10:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 及其檢驗方法綜合介紹

  及其檢驗方法綜合介紹[詳細(xì)]

  2018-11-05 10:00

  產(chǎn)品樣冊

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• 垂直軸偏差測試方法介紹

  本法適用于形狀為圓形的要用玻璃瓶、安瓿瓶的測定。異形瓶一般不使用此方法（瓶底軸線 可固定的除外）。 垂直軸偏差是指瓶口的中心到通過瓶底中心垂直線的水平偏差。[詳細(xì)]

  2023-06-09 11:06

  應(yīng)用文章

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