應用氣相-三重四極桿質譜對不同基因型大米的代謝組學研究

前言

代謝組學是一門應用高通量測試平臺研究生物代謝過程中的小 分子代謝物的科學。作為生物體內眾多代謝反應的產物，其代 謝物的含量始終處于動態變化中。因此，所謂“代謝組特征” 反映的是來自于活體組織的生物樣本的生理狀況。

對于植物來說，其代謝組主要受遺傳基因以及環境影響等外部 刺激作用而在生長過程中不斷變化。因而，通過測試所獲得的 代謝組特征僅為該植物某組織器官在特定生長階段生理狀況的 剪影。對樣本中代謝物的定性和定量結果可作為此代謝組狀態 的“指紋圖譜”或指示譜圖。據估計，所有植物生長過程中存 在超過 20 萬種代謝物，這些代謝物數量眾多，結構復雜多樣。

代謝組學分析的最大挑戰在于代謝物結構性質的多樣性以及含 量的巨大差異。要對整個代謝組體系中的代謝物進行測試，必 須應用多種測試平臺。 對于研究可通過化學衍生法處理進行氣相色譜分析的低分子量 代謝物來說，氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）是絕佳的測試 工具。

在使用氣質聯用儀一級全掃描模式表征代謝物，可識別 相關代謝物并提供其歸一化相對含量信息，然而，對代謝物整 體定量研究的要求是獲得準確的絕對定量信息。在研究大米等 某一植物時，需要對作為功能基因組學工具或區別不同種屬、 品質大米的生物標記物的目標代謝物進行準確定量。

三重四極桿質譜儀由于其在復雜有機樣本中對待測物進行定性 和定量的能力而成為代謝組學研究中極具價值的工具之一。3, 4 三重四極桿質譜的主要優勢是利用其多重反應監測（MRM） 功能，一次進樣同時定性和定量上百種代謝物。MRM 數據采 集模式通過監測目標代謝物獨特的、保留時間相關的母離子- 子離子轉化反應，有效消除基質和噪音的干擾。并且，共流出 化合物也可以分別定量，無需通過數學計算進行解卷積處理。 作為一種食物來源，大米對于我們至關重要，它為約 21% 的 人口提供了能量供給（http://www.knowledgebank.irri.org/）。 

大米的代謝組研究可用于對不同大米樣本進行“指紋圖譜” 識別，以鑒定出具有發展潛力的種屬，從而揀選更好品質、 具備更多營養成分的大米。位于菲律賓馬尼拉的國際稻米研究 機構（International Rice Research Institute, IRRI）是目前亞洲 最大的非營利性農業研究中心。IRRI 以提高稻米產量和營養成 分為目標，專注于稻米的新品種開發。本次分析目的是考察 GC-MS/MS 測試平臺對于檢測不同基因型成熟稻粒目標代 謝物的適宜性。本實驗與 IRRI 合作完成，旨在建立表征不 同種類稻米的代謝特征的測試流程。

樣品前處理

大米提取物的衍生化處理依據 Zhou 等人5發表的用于表征糙 米代謝組學特征而優化的方法完成。將新鮮脫殼的稻粒浸泡于 液氮中，之后研磨過 60 目網篩。稱量 300 毫克糙米粉末，加 入 3 mL 甲醇/水溶液（4:1 v/v），另加入 100 μL 癸酸溶液 （0.30 mg/mL）作為內標物質。上述樣本渦旋 1 分鐘并靜置 30 分鐘，經超聲處理 60 分鐘后 12000g 離心 10 分鐘。取 2 mL 上清液凍干，加入 90 μL 含 1%三甲基氯硅烷（TMCS） 的雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA）和 80 μL 吡啶進行衍 生化。混合物經 75℃ 水浴 45 分鐘后移入裝有 200 μL 內插管 的 2 mL 氣相色譜樣品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有樣 本均在衍生化處理后 24 小時內完成測試。

結論

應用 Thermo Scientific TSQ 8000 對 IRRI 提供的不同基因型的 大米進行代謝組學表征研究，旨在鑒定出能夠區別不同種類、 品質大米的潛在生物標記物。無論代謝組學測試流程中的無目 標性分析還是目標性定量分析，TSQ 8000 均運行良好，展現了 它的一級質譜全掃描、SRM 和同時進行一級質譜全掃描 / SRM  掃描模式對于表征、定量寬動態范圍內的主要代謝物的獨特優 勢。 

盡管 TSQ 8000 質譜儀是一臺三重四極桿質量分析器，在一級 質譜全掃描模式下所獲得的譜圖仍與 NIST 標準譜庫具有良好 的匹配度。通過標準譜庫檢索可對未知化合物進行匹配鑒定， 結果置信度高。同分異構體化合物則可根據其色譜保留時間不 同而進行區別，并可根據其特定的質譜碎裂特征進行選擇性定 量。 

利用 TSQ 8000 配置的 AutoSRM 軟件包建立并優化大米樣品中 包括氨基酸、有機酸、脂肪酸、醇類、糖類（單糖、雙糖）在 內的 66 種代謝物的 SRM 方法。整個 SRM 方法可在 24 小時以 內建立并完成優化，并對 12 種不同的大米樣品中的代謝物進行 測試。定量結果具有高重復率，即使是在基質復雜的衍生化大 米提取物樣品中，超過 90% 的代謝物 RSD 小于 15%。 經測試，所有目標代謝物在各大米樣品中含量差異明顯，均有 作為鑒定不同種類大米的生物標記物的潛力。本次實驗對于未 來的水稻多樣性研究打下良好基礎，有助于提高稻谷品質和大米營養價值。

標簽：三重四極桿質譜