SPRI經(jīng)典磁珠｜逆轉(zhuǎn)錄/體外轉(zhuǎn)錄/RNA-Seq純化方案

SPRI (Solid Phase Reversible Immonilization) 固相可逆固定化是磁珠法核酸純化的基礎(chǔ)。依托這一技術(shù)，AMPure XP磁珠純化方法在NGS、核酸檢測、合成生物學(xué)等領(lǐng)域大放異彩。不只是AMPure XP，貝克曼庫爾特RNAClean XP，針對轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、RNA和cDNA合成等體外應(yīng)用，可提供RNA和 cDNA純化方案。其利用優(yōu)化的緩沖液選擇性地將RNA或cDNA與磁珠結(jié)合。過量的寡核苷酸，核苷酸，鹽和酶可以通過簡單的洗滌程序去除。RNAcleanXP卓 越的核酸回收率和純度，可直接用于下游多項應(yīng)用，已被超20種 RNA-seq 建庫試劑盒建議使用，超過 1000篇文獻(xiàn)引用。

RNAClean XP工作流

采用 RNAClean XP 純化三個不同起始濃度的樣品，0.5 ng/μL，1 ng/μL，5 ng/μL。純化平均回收率達(dá)到75%以上。

RNAclean XP特點

• 認(rèn)證的無核糖核酸酶（RNase）

• 去除鹽、過量的引物和 dNTP

• 不使用有機(jī)溶劑、真空過濾或離心步驟

• 兼容手動和自動化，自動化操作友好，無離心、過濾或沉淀步驟

應(yīng)用案例

應(yīng)用1.

In Vitro Transcription體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物純化

CRISPR sgRNA/ crRNA制備

Peter S. Solomon等1將線性化的sgRNA質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。HiScribe? T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)試劑盒37度18hr反應(yīng)合成sgRNA。隨后采用RNAClean XP磁珠純化sgRNA產(chǎn)物，Qubit定量后??20 °C保存。類似的，Pardis C. Sabeti等2同樣采用RNAClean XP純化以annealed T7 promoter oligo及DNA模板合成的crRNA產(chǎn)物。

Figure. Two-part gRNA和single gRNA結(jié)構(gòu). (From IDT官網(wǎng))

5‘RACE IVT產(chǎn)物純化

Sascha Sauer等3采用cDNA 5′末端快速擴(kuò)增與深度測序（5′ RACE-Seq）評估超出+3核苷酸的序列對T7啟動子活性的影響。實驗發(fā)現(xiàn)+4和+8核苷酸之間的序列motif對轉(zhuǎn)錄輸出影響達(dá)五倍。而這些motifs可以作為IVT反應(yīng)優(yōu)化的指南。其中，RNAclean XP在5′ RACE-Seq和IVT 驗證實驗中，幫助完成T7 RNA合成產(chǎn)物的純化回收。

Figure.  5′RACE-Seq研究T7啟動子受序列影響實驗流程

應(yīng)用2.

rRNA及DNA depletion產(chǎn)物純化

許多N6-甲基腺苷（m6A）mapping方法需要大量的RNA或僅限于培養(yǎng)的細(xì)胞。Dahl等4開發(fā)了皮克級m6A RNA免疫沉淀和測序（picoMeRIP-seq）方法，用于單細(xì)胞和稀有細(xì)胞類型的in vivo m6A研究。在實驗第 一步rRNA和DNA去除環(huán)節(jié)， NEBNext? rRNA Depletion Kit的工具酶處理后，研究人員采用RNAclean XP進(jìn)行post-RNA純化回收。值得注意的是，RNAclean XP也是 NEBNext? rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) 試劑盒中標(biāo)明需使用的磁珠純化試劑。

單細(xì)胞MeRIP–seq方法及分析pipeline

應(yīng)用3.

Nanopore tRNA-Seq 文庫制備

tRNA是翻譯中重要元件之一。Novoa等5開發(fā)了Nano-tRNAseq。這是一種基于納米孔的native tRNA群體測序方法，可在單個實驗中提供tRNA豐度和動態(tài)修飾的定量評估。通過對納米孔raw電流強(qiáng)度信號的重新處理，回收tRNA reads增加12倍，支持準(zhǔn)確的tRNA豐度評估。Nano-tRNAseq實驗過程中，研究人員則是采用貝克曼RNAclean XP磁珠完成5′ and 3′ splint adapter連接產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄后線性tRNA產(chǎn)物，以及ONT RMX sequencing adapter連接產(chǎn)物的純化回收。

應(yīng)用4.

單細(xì)胞RNA純化

分析single B cell的B細(xì)胞受體（BCR）對了解體液免疫反應(yīng)至關(guān)重要。Viant等6-7描述了一種測序，克隆和表征編碼BCR抗體基因的方案。作者采用該方法分析了不同小鼠B細(xì)胞群BCR的體細(xì)胞超突變，克隆和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及它們對同源抗原的親和力。實驗中，采用貝克曼RNAclean XP磁珠完成流式分選單細(xì)胞的RNA純化回收。隨后將RNAclean XP洗脫獲得的痕量RNA用于逆轉(zhuǎn)錄和重鏈輕鏈基因PCR放大。

Figure. 分離B細(xì)胞和產(chǎn)生單克隆抗體的方案流程

自動化加速你的

RNAclean XP實驗

基于SPRI技術(shù)的RNAclean XP磁珠不需要離心或真空抽濾，自動化友好。支持適配貝克曼Biomek i-series自動化工作站，完成工作流中的RNA或cDNA純化實驗。自動化方法一旦編寫、優(yōu)化成型，每一次運行都會按照既定步驟一一完成，標(biāo)準(zhǔn)化你的實驗流程，減少人為錯誤，提高實驗重現(xiàn)性。Biomek i-series自動化系統(tǒng)可配置96通道加樣器，同時處理RNAclean XP樣品的數(shù)目可輕松突破96個樣品，甚至384個樣本。

RNAClean XP自動化工作流及時間預(yù)估

RNAClean XP自動化方法預(yù)覽

Biomek method launcher可將方法歸類，提示實驗所需每種試劑、耗材的擺放指引。方法選項選擇器 MOS則可提供特定于樣品通量、液體體積、時間、洗滌次數(shù)等過程選項和工作流定制的靈活性。幫助你自動化高通量的純化實驗，加速研究進(jìn)程。