牛奶中活性蛋白的分析

乳及乳制品已是我們補充優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源，也是飲食中不可或缺的部分。選擇乳制品時，蛋白質(zhì)的含量是關(guān)鍵指標。乳制品中主要含有哪些活性乳蛋白？如何分析這些乳蛋白？本文分享了一種有效測定牛奶中乳白、乳球和乳鐵蛋白的分析方法，可為液態(tài)奶的工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐。

文/王象欣

牛奶蛋白質(zhì)總量中大約20%^[1]是乳清蛋白。乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（β-Lg，占乳清蛋白50%）、α-乳白蛋白（α-Lac，占乳清蛋白25%）^[2]，其中β-Lg包含β-Lg A和β-Lg B兩種遺傳變異體。常乳中乳鐵蛋白(Lf)的含量受奶牛品種和季節(jié)性的影響很大。^{[3] [4]}

乳鐵蛋白(Lf)是一種能夠與鐵結(jié)合的糖蛋白，可以促進腸道對鐵元素的吸收，提高機體鐵含量^[11]；Lf還被稱作免疫因子，具有抗.菌^[12]、抗病毒^[13]、抗氧化^[14]和調(diào)節(jié)機體免疫力^[15]等作用。GB 14880-2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》將乳鐵蛋白列為了新型營養(yǎng)強化劑，并規(guī)定了其在相關(guān)乳制品中的含量標準。

本研究采用超gao效液相色譜法（UPLC），測定牛奶樣品中乳鐵蛋白(Lf)，α-乳白蛋白(α-Lac)和β-乳球蛋白(β-Lg)的含量。α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)和乳鐵蛋白(Lf)的檢測方法參照GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》對方法進行了確認，滿足標準各項要求。

一、材料與方法

1試劑與耗材

本實驗所用試劑乙腈（CH₃CN）和三氟乙酸（CF₃COOH）為色譜純級別；

氯化鈉（NaCl），磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄），磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄），冰醋酸為分析純；

所用水由Milli-Q超純水儀（默克公司）提供的符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

肝素親和柱（4℃冰箱內(nèi)儲存），規(guī)格為1.5mg，3mL；0.22μm聚醚砜水相濾膜。

2儀器與設(shè)備

超gao效液相色譜儀，配有紫外檢測器；十萬分之一分析天平；高速冷凍離心機；Milli-Q超純水儀；渦旋振蕩器。

3 標準物質(zhì)

本實驗所用標準物質(zhì)為CRM級別，均來自于默克Supelco^?品牌 Cerilliant^?，其中乳鐵蛋白(Lf)的標準品編號為 L-047；α-乳白蛋白(α-Lac)的標準品編號為L-045；β-乳球蛋白(β-Lg)的標準品編號為L-046。

4 分析方法

4.1 乳鐵蛋白的測定

· 稱取10g（精確至0.01 g）牛奶樣品于100mL三角瓶中，先加入30mL結(jié)合緩沖液（84mmol/L Na₂HPO₄，16 mmol/L NaH₂PO₄），渦旋振蕩混勻1min，將樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶，再加入結(jié)合緩沖液定容至50mL后混勻；

· 將樣本轉(zhuǎn)移至離心管于4℃條件下以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質(zhì)，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質(zhì)和下層沉淀。取其中的10mL作為樣品提取液。

·  肝素親和柱先加入5 mL結(jié)合緩沖溶液（84mmol/L Na₂HPO₄，16 mmol/L NaH₂PO₄）平衡，處理完畢后加入樣品提取液，待樣液完全流出后，再用10 mL淋洗液（42mmol/L Na₂HPO₄，8 mmol/L NaH₂PO₄，100 mmol/L NaCl）淋洗，棄去全部流出液。

· zui后用2.5 mL洗脫液（42mmol/L Na₂HPO₄，8 mmol/L NaH₂PO₄，1mol/L NaCl）洗脫，收集全部流出液，定容至3.5 mL。將收集溶液過濾膜，供液相色譜檢測分析用。通過C4色譜柱（100 mm×2.1mm，1.7μm，300?）進行分離。

· 梯度洗脫，流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度條件見表1所示，流速為0.3mL/min，柱溫為45 ℃，進樣量為10μL；通過紫外檢測器280 nm下進行檢測，樣品色譜圖見圖1所示。

表1：乳鐵蛋白梯度洗脫條件

圖1 牛奶樣品中Lf的色譜圖

4.2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測定

· 取5 g（精確至0.01 g）牛奶樣品至50mL離心管中，加入15.0mL水混勻，加入冰醋酸（約30μL）調(diào)節(jié)pH為4.6±0.1左右，渦旋震蕩1min，室溫靜置至少20min后，在10000轉(zhuǎn)，4℃條件下離心10min。

· 取1mL上清液稀釋10倍后，過0.22μm濾膜，上機檢測。通過C4色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm,300?）進行分離。梯度洗脫，流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；

· 梯度條件見表2所示，流速為0.3mL/min ，柱溫為45 ℃，進樣量為10μL；通過紫外檢測器280 nm下進行檢測，樣品色譜圖見圖2所示。

表2：α-乳白蛋白和β-乳球蛋白梯度洗脫條件

圖2 牛奶樣品中α-Lac和β-Lg 的色譜圖

二、實際樣品的測定數(shù)據(jù)

牛奶樣品來自11個省份、自治區(qū)、直轄市的大型超市，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)，抽取試驗所用樣品。其中20種保質(zhì)期為常溫12個月的純牛奶，20種保質(zhì)期為常溫6個月的純牛奶，10種ESL牛奶，15種巴氏殺菌牛奶，每種10個批次。對上述樣品按照2.4所述方法進行分析，結(jié)果如表3所示。

表3：市售樣品中未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量

三、結(jié)論

經(jīng)方法學驗證，3種活性蛋白其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法回收率、精密度符合GB/T 27404-2008中的相關(guān)要求，該方法快速、靈敏、準確，適合牛奶樣品的檢測，也可為液態(tài)奶的工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻：

[1] TAMIME A Y. Milk processing and quality management[M]. Oxford: Blackwell Publishing Ltd., 2009: 25-36.

[2] McSWEENEY P L H, O’MAHONY J A. Advanced dairy chemistry[M]. New York: Springer Science, 2015: 211-295.

[3] Riechel P , Weiss T , Weiss M , et al. Determination of the minor whey protein bovine lactoferrin in cheese whey concentrates with capillary electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A, 1998, 817(1-2):187.

[4] Harmon R J , Schanbacher F L , Ferguson L C , et al. Concentration of lactoferrin in milk of normal lactating cows and changes occurring during mastitis.[J]. American Journal of Veterinary Research, 1975, 36(7):1001.

[5] Salamone D , Lino Bara?ao, Santos C , et al. High-level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 124(2):469-472.

[6] Hattori M , Watabe A , Takahashi K . .BETA.Lactoglobulin Protects. BETA.Ionone Related Compounds from Degradation by Heating, Oxidation, and Irradiation[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1995, 59(12):2295-2297.

[7] Zimet P , Livney Y D . Beta-lactoglobulin and its nanocomplexes with pectin as vehicles for ω-3 polyunsaturated fatty acids[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(4):1120-1126.

[8] SHIRO  KUSHIBIKI , KOICHI  HODATE , JUNICHI  KURISAKI , et al. Effect of β-lactoglobulin on plasma retinol and triglyceride concentrations, and fatty acid composition in calves[J]. Journal of Dairy Research, 2001, 68(4):579-586.

[9] Bleck G T , Wheeler M B , Hansen L B , et al. Lactose Synthase Components in Milk: Concentrations of α‐Lactalbumin and β1,4‐Galactosyltransferase in Milk of Cows from Several Breeds at Various Stages of Lactation[J]. Reproduction in Domestic Animals, 2010, 44(2):241-247.

[10] Segawa T , Sugai S . Interactions of divalent metal ions with bovine, human, and goat alpha-lactalbumins.[J]. Journal of Biochemistry, 1983, 93(5):1321.

[11] Ke C , Lan Z , Hua L , et al. Iron metabolism in infants: influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula[J]. Nutrition, 2015, 31(2):304-309.

[12] Wilson B R , Bogdan A R , Miyazawa M , et al. Siderophores in Iron Metabolism: From Mechanism to Therapy Potential[J]. Trends in Molecular Medicine, 2016:S1471491416301472.

[13] Wakabayashi H , Oda H , Yamauchi K , et al. Lactoferrin for prevention of common viral infections[J]. Journal of Infection and Chemotherapy, 2014, 20(11):666-671.

[14] Wang J , Bi M , Liu H , et al. The protective effect of lactoferrin on ventral mesencephalon neurons against MPP(+) is not connected with its iron binding ability.[J]. Scientific Reports, 2015, 5:10729.

[15] ArciniegaMartínez IM, CamposRodríguez R, Dragoserrano M E , et al. Modulatory Effects of Oral Bovine Lactoferrin on the IgA Response at Inductor and Effector Sites of Distal Small Intestine from BALB/c Mice.[J]. Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis, 2016, 64(1):1-7.

關(guān)于默克Supelco^?牛乳蛋白認證參考物質(zhì)CRM，復制以下鏈接了解更多詳情。

https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/milk-protein-crm.html

“默克分析化學”公眾號為您提供全面的分析化學行業(yè)應(yīng)用和解決方案。本月起，我們將定期邀請行業(yè)專家，分享前沿技術(shù)解讀、行業(yè)應(yīng)用和熱門科研分析。本期我們邀請到的是王象欣老師，原就職于國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中.心，現(xiàn)就職于黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，從事研發(fā)工作，曾參與過嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸的測定標準制定工作，食品安全國家標準食品中肌醇的測定標準制定工作，從事多年嬰幼兒配方乳粉檢測工作，了解嬰幼兒配方乳粉的組成、工藝，熟悉ICP-MS、ICP-OES、HPLC-MS、GC-MS、AFS、AA等大型儀器，熟悉實驗室方法開發(fā)、方法優(yōu)化，方法不確定度評估等工作。

標簽：活性乳蛋白乳鐵蛋白分乳蛋白分析