EPR課堂 | 電子-電子雙共振技術在DNA結構解析中的應用

自20世紀50年代，Watson和Crick提出經典的DNA雙螺旋結構以來，DNA就成為了生命科學研究的核心。DNA中4種堿基的數目及其排列順序會導致基因的多樣性，其空間結構也會影響著基因的表達。

圖片來源：攝圖網

除了傳統的DNA雙螺旋結構，研究發現在人類細胞中還存在著一種特殊的四鏈DNA結構——G-四鏈體。G-四鏈體（G-quadruplex）是由富含串聯重復鳥嘌呤（G）的DNA或RNA折疊形成的高級結構，在迅速分裂的細胞（例如癌細胞）中G-四鏈體的含量特別高。因此，G-四鏈體可作為抗 癌研究中的藥物靶點。研究G-四鏈體的結構及其與結合劑的結合模式，對于癌細胞的診斷與治療具有重要的意義。

G-四鏈體的三維結構示意圖。圖片來源：wikipedia

電子-電子雙共振技術

脈沖偶極電子順磁共振（Pulsed Dipolar EPR，PDEPR）方法已經發展成為結構和化學生物學中可靠和通用的結構測定工具，通過PDEPR技術可在納米尺度上提供距離信息。在G-四鏈體結構研究中，使用電子-電子雙共振（electron-electron double resonance，DEER）技術結合定點標記（site-directed spin labeling，SDSL）技術可區分不同長度的G-四鏈體二聚體并揭示G-四鏈體結合劑與二聚體的結合模式。

利用DEER技術區分不同長度的G-四鏈體二聚體

使用Cu(pyridine)4作為距離測量的自旋標記，將四方平面Cu(pyridine)4復合物與G-四鏈體共價結合，通過檢測偶極-偶極相互作用測量π-堆疊的G四元單體中兩個順磁Cu2+之間的距離，從而研究二聚體的形成。

[Cu2+@A4]（TTLGGG）與[Cu2+@B4]（TLGGGG）為兩種具有不同序列的寡核苷酸，其中，L表示配體。圖1和圖2為[Cu2+@A4]2和[Cu2+@B4]2的DEER實驗結果，從DEER結果中可得到[Cu2+@A4]2二聚體中，單個Cu2+ -Cu2+的平均距離dA=2.55 nm，G-四鏈體3′端通過尾尾疊加形成G-四鏈體二聚體，且G-四鏈體二聚體中兩個Cu2+自旋標簽的gz軸平行排列。

與[Cu2+@A4]2二聚體相比，[Cu2+@B4]2  π堆積距離比 [Cu2+@A4]2二聚體長（dB-dA = 0.66 nm），證實了每個[Cu2+@B4]單體含有一個額外的G四分體，這個結果與預期距離完全一致。因此，通過DEER技術進行距離測量，可區分不同長度的G-四鏈體二聚體。

圖1 (A) [Cu2+@A4]2二聚體的脈沖EPR微分譜(黑線)及其對應的模擬(紅線) (34 GHz，19 K); (B)背景校正后在a-d四個場位置的DEER時域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的最佳擬合結果(紅線); (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布; (D) [Cu2+@A4]單體和[Cu2+@A4]2二聚體之間的平衡。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

圖2 (A)[Cu2+@B4]2背景校正后在a-d四個場位置的DEER時域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的最佳擬合結果(紅線); (B)[Cu2+@B4]的結構示意圖; (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

利用DEER技術探究G-四鏈體結合劑與二聚體的結合模式

許多小分子和金屬配合物，具有平面芳香大共軛體系且帶正電荷，可以結合并穩定折疊的二級結構，從而成為潛在的抗 癌藥物。

N,N ' -雙[2-(1-哌啶基)乙基]3,4,9,10-苝四羧基二酰鹽酸鹽（PIPER）就是一種著名的G-四鏈體結合劑，可通過堆積作用與四鏈體結合并穩定四鏈體，通過DEER技術可探究PIPER與G-四鏈體的結合模式。

圖3與圖4為不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER實驗結果。結果顯示，當PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為1：1時（PIPER@[Cu2+@A4]2），dP = 2.82 nm。

與純[Cu2+@A4]2二聚體（dA = 2.55 nm）相比，Cu2+-Cu2+之間距離增大，說明了PIPER與二聚體形成了三明治復合物，平面有機分子插在兩個G四聯單體的3′面之間。當PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為2：1時（2PIPER@[Cu2+@A4]2），d2P = 3.21 nm。

與PIPER@[Cu2+@A4]2二聚體（dP = 2.82 nm）相比，多了一個π堆積的距離，說明兩個PIPER配體插入到尾對尾排列的G四鏈二聚體中。通過DEER技術可揭示G -四鏈體結合劑PIPER插入G-四鏈體二聚體中形成夾層復合物的新結合模式。

圖3 (A)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER偶極譜(geff =2.061); (B)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER調制深度;(C)[Cu2+@A4]2二聚體和PIPER@[Cu2+@A4]2、2PIPER@[Cu2+@A4]2、PIPER@[Cu2+@A4]的平衡。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

圖4 (A)PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時域譜;(B)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布; (C)2PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時域譜; (D)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的2PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

國儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀

國儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100支持電子-電子雙共振技術，可用于研究復雜膜蛋白、DNA、RNA、核酸蛋白復合體以及在各種疾病中產生關鍵作用的相關蛋白質分子的結構定位、功能解釋、生理運動過程以及作用機理解釋。

國儀量子X波段脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100

國儀量子EPR100的DEER實驗結果

使用DeerAnalysis處理后的實驗結果

標簽：電子雙共振技術