一種快速、高通量的病毒中和抗體檢測(cè)方法

本文由 美谷分子儀器（上海）有限公司 整理匯編

2022-03-23 16:41 765閱讀次數(shù)

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  新冠病毒的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的新冠大流行，為了理解病毒的發(fā)病機(jī)理并開(kāi)發(fā)疫苗，亟需快速開(kāi)發(fā)多種研究工具。檢測(cè)病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對(duì)新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測(cè)有效性的重要參數(shù)。 人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗(yàn) (PRNT) 來(lái)檢測(cè)。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細(xì)胞中，所以需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及耗時(shí)費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費(fèi)時(shí)間并且不能自動(dòng)化。此外，假病毒中和試驗(yàn) (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，但此方法需要細(xì)胞培養(yǎng)和熒光成像來(lái)測(cè)得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。[詳細(xì)]

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  豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)1符合率試驗(yàn)PCV2ELISA與間接免疫熒光檢測(cè)方法（IIF）的比較由上表結(jié)果顯示ELISA方法陽(yáng)性檢出率為63.3%,陰性檢出率為36.7%；而用豬2型圓環(huán)病毒間接免疫熒光試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率為59.2%,陰性檢出率為40.8%。其中兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性符合率為90.3%,陰性符合率為94.4%，總符合率為91.8%。表明ELISA在測(cè)定抗體效價(jià)時(shí)較為敏感。注：間接免疫熒光檢測(cè)方法（IIF）是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)圓環(huán)病毒經(jīng)典方法。PCV2ELISA與荷蘭塞迪的捕獲ELISA試劑盒（商品化）的比較用PCV2ELISA試劑盒檢測(cè)117份豬血清，結(jié)果陽(yáng)性率為72.65%，陰性率為28.35%。對(duì)比國(guó)外試劑盒檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性率為70.94%，陰性率為29.06%。陽(yáng)性符合率為64.96%，陰性復(fù)核率為21.37%，總符合率為86.32%。注；荷蘭塞迪的捕獲ELISA試劑盒（商品化）在國(guó)內(nèi)使用的比較少，其效果還有待驗(yàn)證。豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用說(shuō)明書(shū)【簡(jiǎn)介】試劑盒由抗原包被的微孔板，酶標(biāo)羊抗豬IgG及其它試劑制成，應(yīng)用間接ELISA原理檢測(cè)豬血清中抗Ⅱ型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的抗體。【用途】豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)診斷試劑盒用于檢測(cè)豬血清中抗Ⅱ型圓環(huán)病毒ORF2蛋白的抗體。評(píng)估豬場(chǎng)圓環(huán)病疫苗免疫狀況。感染豬的血清學(xué)診斷。【原理】本試劑盒是采用豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的工程表達(dá)產(chǎn)物包被微孔板，在試驗(yàn)中，加入稀釋的對(duì)照血清和待檢血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有抗豬圓環(huán)病毒2型ORF2蛋白特異性抗體，則將與檢測(cè)板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標(biāo)二抗，與檢測(cè)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，在孔中加TMB底物液，與酶反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入HF溶液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀630nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔中的OD值。【試劑盒主要成分】1包被抗原的微孔板2塊（96孔/塊）2陰、陽(yáng)性對(duì)照血清各1管（1ml/管）3羊抗豬酶標(biāo)二抗1瓶（30ml/瓶）420倍濃縮洗滌液1瓶（50ml/瓶）5底物A液、B液各1瓶（10ml/瓶）6終止液1瓶（10ml/瓶）7樣品稀釋液1瓶（50ml/瓶）8血清稀釋板2塊（96孔/板）9說(shuō)明書(shū)1張【樣品制備】取動(dòng)物全血，按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無(wú)溶血。【洗滌液配制】使用前，濃縮的洗滌液應(yīng)恢復(fù)至室溫（25℃左右），并搖動(dòng)使沉淀的鹽溶解（**在37℃水中加熱5-10min），然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋?zhuān)ɡ纾好堪逵?0ml濃縮液加上380ml水），稀釋好的洗滌液在4℃可以存放7天。【樣品稀釋】在血清稀釋板中按1：40的體積稀釋待檢血清（195μl樣品稀釋液中加5μl待檢血清）。注意：陽(yáng)性和陰性對(duì)照1：4稀釋?zhuān)?80μl樣品稀釋液中加60μl對(duì)照血清，吹打均勻）。【注意事項(xiàng)】1試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，使用后放回2-8℃。2不同批號(hào)試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時(shí)應(yīng)防止試劑污染。3不要用口移液。4TMB（底物液B）不要暴露于強(qiáng)光，避免接觸氧化劑。5檢測(cè)板拆封后避免受潮或沾水（未用完的抗原包被板加干燥劑放于自封袋中，應(yīng)盡快置于2-8℃）。6待檢血清樣品數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)先使用血清稀釋板稀釋完所有要檢測(cè)血清，再將稀釋好的血清轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板，使反應(yīng)時(shí)間一致。7濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋?zhuān)绻l(fā)現(xiàn)有結(jié)晶加熱使其溶解后再使用。8嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)可以獲得**的結(jié)果，操作過(guò)程中移液，定時(shí)和洗滌等的全過(guò)程必須極ng確。豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)【操作步驟】1取檢測(cè)板（根據(jù)樣品多少可拆開(kāi)分次使用），用稀釋好的洗滌液洗板2次（200l/孔）每次靜置2分鐘后倒掉，再在干凈吸水紙上拍干。2取稀釋好的待檢樣品100μl加入到檢測(cè)板中；陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)2孔，每孔100μl；輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30分鐘。3甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200μl/孔，每次靜置3分鐘倒掉，再在干凈吸水紙上拍干。4每孔加羊抗豬酶標(biāo)二抗100μl，置37℃溫育30分鐘。5洗滌5次,方法同3。切記每次在干凈吸水紙上拍干。6每孔先加底物液A一滴（50l）、再加底物液B一滴（50l），混勻，室溫（18℃-25℃）避光顯色10分鐘。7每孔加終止液1滴（50μl），10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果（檢測(cè)前在震蕩器上輕輕震動(dòng)一下）。【結(jié)果判定】在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔OD630值。試驗(yàn)成立的條件是陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值大于或等于1.0，陰性對(duì)照孔平均OD630值必須小于0.3。樣品OD630值大于0.42，判為陽(yáng)性；樣品OD630值在0.38到0.42之間，判為可疑；樣品OD630值小于0.38，判為陰性。注意：用620~650納米波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果均有效。【貯存】2-8℃避光保存【有效期】6個(gè)月[詳細(xì)]

  2018-09-14 10:01

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