掃描電鏡觀察細胞樣品

　　掃描電鏡是自上世紀60年代作為商用電鏡面世以來迅速發展起來的一種新型的電子光學儀器，被廣泛地應用于化學、生物、醫學、冶金、材料、半導體制造、微電路檢查等各個研究領域和工業部門。

掃描電鏡樣品處理方法

　　單固定半程序微波輻射法：

　　微波輻射可應用于掃描電鏡細胞樣品的制備。處理培養細胞的過程是先將一直徑為15cm、內盛200ml水的培養皿置于微波爐內，先用低檔微波輻射8min預熱，用溫度計測水溫，起始溫度約為20℃，使終止溫度為30±5℃。如果溫度超過35℃，則加冷水降溫。隨后將裝有樣品和浸泡液的小瓶放于培養皿內，再繼續用微波處理2min，并使樣品保持在35℃環境中。除干燥外，固定、脫水、置換均在爐內進行。

　　具體步驟為：①前固定：在裝有樣品的小瓶中加入適量的2.5%的戊二醛，一般為樣品的10倍。微波輻射5min，爐外原液停留30min。②漂洗：每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。③脫水：乙醇逐級脫水，依次為：50%，70%，90%，1**%。每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。④置換：純乙酸異戊酯溶液置換三次，每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。⑤干燥：CO2臨界點干燥。

　　該方法對于貼壁培養的細胞較適用。在游離細胞超快掃描電鏡樣品制備中，還有另一種方案。在制備高等植物的掃描電鏡樣品時，建立了全程序微波輻射法，其方法與上述方法不同之處在于植物樣品的干燥也是借助微波，利用微波爐解凍檔，起始溫度為60℃，終止溫度70±3℃，干燥3~4min。

　　單固定氯化金染色法：

　　對生物樣品而言，氯化金有良好的導電性，但沒有固定作用，使其在掃描電鏡樣品制備中的應用受到限制。但利用氯化金代替鋨酸，制備掃描電鏡和透射電鏡樣品，觀察結果顯示其圖像質量符合要求。用氯化金替代鋨酸，對貼壁培養的細胞進行制樣。

　　具體步驟為：①固定：2.5%戊二醛固定2h。②前漂洗：0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗二次，每次10min。③后漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次10min。④浸漬染色：2%氯化金兩次，每次1.5h。⑤前漂洗：0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗2次，每次10min。⑥后漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次10min。⑦脫水：乙醇逐級脫水，依次為50%，70%，90%，1**%，1**%，每次10min。⑧置換：純乙酸異戊酯置換20min或過夜。⑨干燥：CO2臨界點干燥。

　　單固定快速脫水法：

　　操作程序為：①固定：2.5%戊二醛固定30min。②脫水：乙醇逐級脫水，依次為：70%，90%，1**%，1**%，每次5min;③置換：純乙酸異戊酯置換5min;④干燥：CO2臨界點干燥。對于不同的樣品要采用合適的方法，才能得到理想的效果。

掃描電鏡細胞樣品觀察步驟

　　1、取材

　　掃描電鏡下觀察的樣品尺寸要求比較寬松，一般1cm3左右樣品都能適合大多數掃描電鏡觀察。

　　2、固定

　　鋪片培養的細胞取出浸入PBS中，漂洗細胞表面。然后將細胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預冷的3%戊二醛，在4℃固定2h或過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預冷的1%鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。

　　3、脫水

　　丙酮/醋酸異戊酯(1：1)脫水10min，接下來醋酸異戊酯脫水30min，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、1**%)脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15min。

　　4、干燥

　　以臨界干燥法Z理想，但必須要有專門的儀器臨界點干燥器。當實驗室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關鍵是乙腈置換。樣品經上述處理后，浸入520%的乙腈溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、1**%的乙腈溶液，每次浸泡15-20min，Z后再換1**%乙腈。然后進行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的真空裝置內，抽低真空，一般需30-50min。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時再放氣，取出樣品。

　　5、樣品導電處理

　　用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，掃描電鏡樣品被安置在離蒸發源約10-15cm處的樣品臺上，樣品進行旋轉活動，先噴碳。后噴金，噴鍍應均勻，完成后鏡下觀察。