教你兩步完成肝素效價的測定

精簡版
我們提供給您符合中國藥典生物檢定法要求 的 4.4 法分析模板，第一步將模 板導入 SoftMax Pro 7 軟件，第二步點擊Read 進行板測讀，隨后平行線性擬合、方差分析和可靠性檢驗結果、供試品效價及其可信限全部自動計算出來。
肝素及其效價測定方法介紹
肝素首先從肝臟發現而得名，它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是一種由動物結締組織的肥大細胞合成的粘多糖，是由二種多糖交替連接而成的多聚體。它是一種天然的抗凝血物質，在體內外都有抗凝血作用，臨床上常用其鈉鹽或鈣鹽。肝素鈉或肝素鈣注射液主要是從豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽或鈣鹽，作為迅速達到抗凝作用的shouxuan藥物，被廣泛用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環、血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。
肝素類產品的效價不能用化學或物理的方法進行確切測定，只能采用生物檢定法測定，即利用藥物對生物體的作用并與標準品加以比較以測定其效價和生物活性的一種方法。目前體外的抗凝活性實驗主要有血漿法和生色底物法，血漿法雖然可以全面衡量肝素的抗凝活性，卻很難標準化；生色底物法測定肝素鈉的抗 IIa 因子和 Xa 因子活性雖然不能完全反映肝素鈉的活性，但國際上通常采用這種方法來確定肝素鈉的效價。歐洲藥典 5.0 版和我國藥典均采用該方法，美國藥典從 2009 年開始采用生色抗 IIa 因子測定法代替此前藥典中的羊血漿法測定肝素效價。生色底物法Z大的優點是它在效價測定中的高度專一性，能夠識別出此前藥典中血漿法不能識別的肝素相似性潛在藥物，并且酶標儀的使用使常規測定自動化和標準化。

儀器型號
? SpectraMax M2e 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機
? SpectraMax iD3 多功能微孔板讀板機

生色底物法的原理是通過微量顯色法比較肝素鈉標準品 S 與供試品 T 抗 IIa 因子和 Xa 因子的活性，以測定供試品的效價。效價是某種藥物達到一定效應時所需的劑量，產生相同效應藥物的劑量比較時，所需劑量越小，藥物的效價就越高，反之效價就低。在人或動物體內，發生凝血作用的主要是凝血酶，低分子肝素在人體內與抗凝血酶形成絡合物，然后抑制凝血酶 ( IIa 因子或 Xa 因子 ) 的活性，達到抗凝血的作用，剩余未被抑制的 IIa 因子或 Xa 因子與生色底物作用顯色，使用酶標儀在 405nm 波長處讀取吸光度，終溶液的吸光度值與低分子肝素的效價成反比。以吸光度為縱坐標，標準品系列溶液 ( 或供試品系列溶液 ) 濃度的對數值為橫坐標分別作線性回歸，按生物檢定統計法 ( 通則 1431 ) 中的量反應平行線原理 4.4 法實驗設計，計算效價及實驗誤差，藥典要求可信限率(FL%) 不得大于 10 %。
使用 SoftMax Pro 7 軟件進行肝素效價測定
生物檢定統計法中涉及 到 的 F 檢驗分析方法的推算比較復雜，大多數酶標儀的軟件是無法完成這些計算的，但是，
Molecular Devices 公司的酶標儀軟件 SoftMax Pro 7 具備強大的函數編寫能力，能夠幫助實驗人員完成藥典中要求的
生物檢定統計法的所有分析方法，包括量反應平行線測定法和四參數回歸計算法。下面小編以一組實驗數據來詳細說明，在SoftMax Pro 7 軟件中如何進行肝素生物效價的測定，并將方差分析和和測定結果與 BS2000 軟件進行比較。
1. 加樣原則
為了減小實驗系統操作誤差，實驗人員應該按照均衡分配各樣品在 96 孔微孔板中的不同位置。例如在一塊 96 孔微孔板
上分配一組標準品溶液 S1~S4 和一組供試品溶液 T1~T4，可以采用 STTS 的樣品排列方式 ( 見圖 1 )。操作熟練的實驗人員可以選擇同一次反應內測定多批供試品的效價，同時測定兩批供試品 (A 和 B) 可采用 SABBAS 的排列方式；依次類推，同時測定三批供試品 ( A、B 和 C ) 可采用 SABCCBAS 的排列方式 ( 見圖 2 )。
 

2. 實驗數據測讀
在 SoftMax Pro 7 軟件中進行相應排列方式的板布局設置，并輸入標準品系列溶液和供試品系列溶液的劑量。本次實驗
只有一組標準品溶液和一組供試品溶液，S 和 T 采用同等劑量稀釋， Z大劑量是 0.049 IU/ml，高低劑量劑間比是 1.4，然后在 405 nm 波長下進行讀數，稀釋劑量和檢測結果如圖 3所示。

3. 平行線性擬合
當標準品 S 和供試品 T 的對數劑量和反應關系的兩條直線相互平行時，供試品和標準品的活性組分才是相同的，進而才
能計算 S 和 T 的等反應劑量，從而對比出供試品的效價 Pt，所以曲線的平行性分析是生物效價測定的前提。在 SoftMaxPro 軟件中，以對數劑量作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標，對 S 和 T 進行平行線性擬合 ( 即線性約束模型擬合 )，兩條直線強制變為平行，S 和 T 擬合方程的 B 參數 ( 代表斜率 ) 的估計值是相同的，僅 A 參數 ( 代表水平截距 ) 的估計值不同。在95% 的置信水平下，軟件自動計算出 F 檢驗概率值 (F Prob)，見圖 4 紅框所示， F Prob > 0.05，表明兩條直線是平行的，反之兩條直線是不平行的。