透射電鏡生物樣品制備

　　透射電鏡，全稱透射電子顯微鏡，可以看到在光學顯微鏡下無法看清的小于0.2um的細微結構，這些結構稱為亞顯微結構或超微結構。透射電鏡成像方式與光學生物顯微鏡相似，只是以電子透鏡代替玻璃透鏡。

　　一、取材

　　1、動作迅速：組織離體后，應將其快速放入4℃戊二醇固定液中，使組織細胞盡可能保持原來的生活狀態(tài)。

　　2、減少損傷：選擇鋒利切割器械，減少牽拉或擠壓組織。

　　3、組織塊大小：透射電鏡樣品取材可先切成長條形，然后再修成約1mm2大小。

　　二、固定

　　固定目的是把細胞在活體狀態(tài)時的超微結構細節(jié)盡可能完整地保存下來，避免自身酶的分解而出現(xiàn)自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而產(chǎn)生腐敗，致使細胞的超微結構遭受破壞。同時也使細胞內(nèi)的各種成分固定下來，避免以后的沖洗和脫水時溶解和流失。

　　理想的透射電鏡樣品固定劑應具備以下特點：能夠迅速又均勻地滲透到組織結構內(nèi);能夠穩(wěn)定細胞各種結構成分，使之在以后處理過程中不致溶解和丟失;對細胞超微結構沒有損傷;能供細胞化學測定并能增強圖像反差。當然，滿足所有要求的固定劑是不存在的，目前常用固定劑有鋨酸和戊二醇。

　　1、使用鋨酸的注意事項：

　　鋨酸即四氧 化鋨，它能和細胞內(nèi)絕大多部分成分反應，且能夠保護脂肪，但對碳水化合物、糖類和核酸保護作用差，鋨酸滲透差，分子密度大，經(jīng)鋨酸固定的組織在透射電鏡下能獲得較好反差。鋨酸為劇毒、極易揮發(fā)的試劑，對呼吸道有強烈刺激作用，必須在通風櫥中操作，廢液必須收集在密閉容器中。常用的鋨酸溶液為2%的儲備液，使用之前需用0.2MPBS稀釋成1%的鋨酸溶液。

　　2、戊二醇：

　　戊二醇能夠穩(wěn)定糖原，同時保存某些鋨酸保護作用差的蛋白質(zhì)結構，對酶活性破壞小。對微管、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定較好，對脂肪保護差，且反差小，因此必須和鋨酸配合使用，即“雙重固定法”。

　　3、固定方法：

　　透射電鏡樣本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，經(jīng)PBS緩沖液多次清洗后再用1%鋨酸固定2h。根據(jù)不同組織，可適當延長固定時間。由于戊二醇能夠和鋨酸反應產(chǎn)生電子致密的還原鋨沉淀，組織經(jīng)戊二醇固定后，必須將戊二醇清洗干凈才能轉入鋨酸。此外，鋨酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此鋨酸固定后也應用PBS洗液進行清洗干凈方能進行脫水處理。一般清洗3次，每次15min左右(或過夜)。

　　三、脫水

　　脫水是將組織中的游離水徹底清除的過程。由于常用的包埋劑，如環(huán)氧樹脂，大多都是非水溶性樹脂，只有將生物組織中的游離水清除干凈，包埋劑才能浸入組織，常用脫水劑是乙醇和丙酮。乙醇對細胞物質(zhì)抽提少，組織收縮也少，但它和環(huán)氧樹脂互溶性差，因此使用乙醇脫水時須用環(huán)氧丙烷作為中間溶劑。丙酮和酒精、環(huán)氧丙烷互溶，所以通常先用乙醇后再用丙酮的脫水方法。急劇脫水會引起細胞收縮，因此應采用逐級脫水(50%-70%-90%-1**%乙醇)而不能急劇脫水。更換溶液時動作要快，特別是不要讓組織離開溶液，否則會在組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡;脫水過程中若要長時間停留或過夜，應放在70%乙醇或丙酮中，并在4℃保存。

　　四、包埋

　　1、滲透：

　　滲透就是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細胞內(nèi)外空隙被包埋劑所填充。一般可先用環(huán)氧丙烷對半稀釋的包埋劑浸透1-2h，再用純包埋劑37℃烤箱滲透2h左右。包埋劑通常由樹脂、硬化劑、增塑劑及催化劑4種試劑按一定比例配制而成。

　　2、包埋：

　　目的是以包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅硬固體。理想包埋劑應具備的條件：黏稠適中，有良好切割性;能經(jīng)受電子轟擊;透明度較好;對人體無害。

　　3、環(huán)氧樹脂：

　　環(huán)氧樹脂為熱塑性樹脂，主要有兩種化學反應基團，即環(huán)氧基和羥基。末端環(huán)氧基易與其他含活性氫原子化合物如胺類反應，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。單體中羥基能與酸酐結合，形成分子間橫橋連接。因此，把環(huán)氧樹脂單體、胺類、酸酐等三者按一定比例混合，加上適當溫度，可形成穩(wěn)定的交鏈狀聚合物。

　　包埋劑配制及使用過程中的注意事項：

　　①所有容器及玻璃棒等應是清潔和干燥的;

　　②配制過程中應攪拌均勻，使用過程中應避免異物，特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑;

　　③配制好的包埋劑應密封保存，避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲存在-10~-20℃冰箱中，延長其使用期。

　　五、切片

　　1、修塊

　　首先粗修把多余樹脂磨掉，然后在雙筒鏡下把端面修平，使組織面暴露，然后再修成45°四面錐體。頂端面可修成長方形或梯形，注意上下面平行。半薄切片頂端面積以1-2mm左右為宜，修成直角梯形便于定位。

　　2、切片操作

　　固定好組織塊，調(diào)整刀的高低、角度和刀刃位置，調(diào)整刀槽內(nèi)的液面，調(diào)整組織塊與刀的距離，選擇切片速度及厚度。可根據(jù)干涉色判斷切片厚度：灰色40-50nm;銀白色50-70nm;金黃色70-90nm;色90nm以上。灰色、銀色較薄，但反差小，金色分辨率低，反差好，紫色太厚，一般不能觀察。

　　六、染色

　　1、醋酸鈾：是目前應用Z廣泛染色劑，能和大多數(shù)成分相結合，對核酸、核蛋白、結締組織纖維、糖原、分泌顆粒、溶酶體均可染色，但對膜結構染色效果較差。醋酸鈾在水和乙醇中溶解度較差，一般用50%或70%乙醇或丙酮配制成2%-3%的溶液。組織塊染色1-2h，切片染色30min即可。長時間染色可引起糖原抽提和組織變形。

　　2、枸櫞酸鉛：鉛染色其應用也很普遍，它具有很高的電子密度，對細胞超微結構均有廣泛親和力，能提高細胞膜系統(tǒng)及脂類反差。鉛染液易與空氣中二氧化碳接觸形成碳酸鉛沉淀，污染切片。一般染10-20min即可，長時間染色可使反差全部增強，不利于觀察。