NanoBRET 技術特點及如何利用 SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機進行相應檢測

簡介
研究蛋白質之間的相互作用 (PPI) 對于探索細胞功能及信號轉導通路來說至關重要，目前有許多種方法來研究蛋白質之間的相互作用。其中包括免疫共沉淀技術，以及基于熒光基礎理論的熒光共振能量轉移技術 (FRET)， 由于基于熒光的方法依賴于激光或高能氙閃燈作為光源來對樣品的進行激發，因此往往容易產生光漂白和背景熒光等問題，從而大大限制了基于熒光方法的實用性。一種可以替代的方法，生物熒光共振能量轉移 (BRET)，是利用熒光素酶催化的化學反應來產生光學信號，由于這種方法無需外置光源激發作用，BRET 可以有效避免由于外來光源激發帶來的種種弊端。
來自于 Promega 的 Nano BRET 技術，其利用了 NanoLuc 熒光素酶作為 BRET 檢測供體分子，標記有 HaloTag 熒光基團的蛋白發射 618 nm 熒光波長作為受體分子。發生紅移現象的受體分子減少了供體和受主熒光信光譜的光譜重疊作用 ，較替他類型的BRET 方法具有更好信噪比，如 Renilla 熒光素酶為供體，YFP 或GFP 作為受體的 BRET1和 BRET2。

本篇技術性短文介紹了如何利用 SpectraMaxi3x 多功能微孔板讀板機進行 NanoBR ET 檢測，分別介紹了如何利用儀器內置的檢測模式進行 NanoBRET 檢測以及如何利用具有更高靈敏度的 NanoBRET 卡盒進行相應檢測，如果利用更靈敏的檢測卡盒可將定量檢測下限提高四倍以上。
驗證方法
利用 Promega 提供的一種用 NanoBRET 質控蛋白檢測體系的實驗方案來優化儀器設置并探索其不同條件下的檢測下限，將梯度濃度稀釋的具有 NanoBRET 活性的蛋白標準品固定在白色 96 孔板上用于相應的檢測，這些測量值用于生成線性回歸計算和定量其檢測下限 (LOQ) 值，可以測量儀器性能。此驗證方案使用 SpectraMax i3x 微孔板讀板機內置化學發光檢測模式或專用 NanoBRET檢測卡盒分別進行檢測獲得結果。
材料
? 白色 96 孔板
? 1XPBS 緩沖液 ( 包括 0.1BSA )

? NanoBRET 質控蛋白-5 瓶的含量分別如下
? NanoBRET 質控蛋白 1:0%
? NanoBRET 質控蛋白 2:0.1%
? NanoBRET 質控蛋白 3:1%
? NanoBRET質控蛋白4:10%
? NanoBRET質控蛋白5:100%
? NanoBRET Nano-Glo 底物 ( NanoBRET 檢測體系 )
? SpectraMax i3x 多功能微孔板讀板機
? NanoBRET 檢測卡盒
檢測方法
? 將 50 μl 質控蛋白分別以 3 個復孔方式加入96 孔板中
? 準 備 2 0 μ M 的 1 X P B S / 0 . 1 % B S A 的NanoBRET 的 Nano-Glo 底物溶液 ( 5 nM儲存液以 250 倍的方式進行稀釋)
? 加入 50 μl 底物溶液使之每個孔的終濃度為10 μM
? 在底物加入的十分鐘內進行相應檢測，使用具有 NanoBRET 檢測功能的儀器來分別檢測供體發射光強度 (450 nm) 和受體分子發射光強度 (610 nm)

數據分析
? 產生的 NanoBRET 信號比率，即受體分子信號/供體分子信號
? 確定 NanoBRET 檢測每組數據的平均比率和相對標準偏差
? 所有其他數據組平均比率值減去 0% 組數據的平均比率值，獲得校正過的 NanoBRRT值，代表了真正的能力轉移信號值
? 繪制校正獲得 NanoBRET 比率值曲線并選擇線性回歸方式進行擬合，計算曲線斜率，曲線應該強制 X,Y = 0 ( 因為沒有檢測到受體分子信號強度的話 NanoBRET 現象就不會產生 )
? 計算定量下限 (LOQ)，哪個代表了 BRET 配對相對于總供體 ( 部分占用率 ) 的Z小百分比，可以從統計學上與單獨供體區分開，LOQ = ( 10*SD 0% 樣品 ) /斜率。

結果
SpectraMax i3x 多功能微孔板斷布機進行NanoBRET 的檢測專用模塊情況下，LOQ 為0.58%，使用內置的發光檢測模塊情況下可達到 LOQ 為2.6%，專用檢測模塊可以提升微弱限號檢測靈敏度和動態學范圍，儀器內置化學發光檢測模塊更適用于信號比較強的實驗。