使用Beacon Analytical Systems三聚氰胺孔板試劑盒和Molecular Devices光吸收酶標儀進行高通量三聚氰胺檢測

介紹
有機堿三聚氰胺用于制造許多產品，包括塑料、阻燃劑、顏料和化肥。Z近在動物飼料和人類食用食品中添加三聚氰胺以增加蛋白質含量的做法已被報道。由于三聚氰胺污染可導致動物和人的嚴重疾病或死亡，人們對確定檢測各種食品中三聚氰胺污染的方法越來越感興趣。

在此應用說明中，我們介紹和驗證了 Beacon AnalyticalSystems 公司的三聚氰胺孔板試劑盒。Beacon 三聚氰胺孔板試劑盒是一種競爭性的酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)，用于對污染樣品中的三聚氰胺進行定量分析。使用該試劑盒可檢測多種樣品類型，包括乳制品、麥麩和干濕寵物食品。三聚氰胺是通過與提取液混合或震蕩從樣品中提取出來的。然后將三聚氰胺 HRP 共軛物，樣品提取物和校準物吸移到包被了三聚氰胺抗體的測試孔中。 孵育 30 分鐘后，將孔洗滌以除去未結合的三聚氰胺，然后將底物添加到孔中。30 分鐘后停止反應，并使用帶有光吸收功能的酶標儀測量孔的吸光度。測試樣品的三聚氰胺濃度由三聚氰胺標準曲線計算得到。
來自 Molecular Devices 的光吸收酶標儀用于檢測三聚氰胺測定實驗中的吸光度。Molecular Devices 的AquaMax4000 微孔板清洗機同時吸出并分配所有微孔板孔，以快速完成所需的清洗步驟。數據收集和分析使用 SoftMaxPro GxP 軟件中的三聚氰胺 ELISA 預先設置的模板，SoftMaxPro GxP 軟件是符合 FDA 21 CFR Part 11 的行業標準分析軟件。

材料
具有光吸收檢測模式的 Molecular Devices酶標儀：
? SpectraMax Plus 384 (cat. #PLUS 384)
? SpectraMax 190 (cat. #190)
? SpectraMax 340PC384 (cat. #340PC 384)
? VersaMax? (cat. #VERSAMAX)
? SpectraMax M2/M2e (cat. # M2 or M2E)
? SpectraMax M5/M5e (cat. #M5 or M5E)
? FlexStation 3 (cat. #FLEX3)
? SpectraMax i3x (cat. #i3x)
? SpectraMax iD3 (cat. #iD3)
Molecular Devices AquaMax 4000 微孔板清洗機( 按需配置 )三聚氰胺孔板試劑盒 (Beacon AnalyticalSystems, cat. #20-0158)

優勢
? 三聚氰胺污染檢測的質量保證篩選方案
? 降低人工操作的處理方式提高其通量
? 使用 SoftMax Pro GxP 軟件進行完整的數據分析
方法
采用以下測試步驟 (1)：
? 在進行測試之前，讓試劑達到室溫。
? 將適當數量的包被有三聚氰胺抗體的測試孔放在微孔支架中。 將剩余的測試孔重新密封在提供的拉鏈袋中。 將另外的非抗體包被的孔置于微孔架中，以使所有 96 個位置均被占據。這樣就可以使用 AquaMax4000 微孔板清洗機，該清洗機可以一次清洗所有 96 孔。
? 使用帶有一次性吸頭的移液器將 150 μL校準品 ( 一式三份 ) 或稀釋的樣品提取物添加到適當的測試孔中。每個都使用干凈的移液器吸頭。
? 向每個孔中添加 50 μL 三聚氰胺 HRP 共軛物。
? 將板輕輕震蕩 60 秒，然后在室溫下孵育30 分鐘。
? 抽吸孔中的內容物，并使用 AquaMax4000 微孔板清洗機分配 250 μL 洗滌溶液(1x PBS / 0.05％Tween-20)，總共進行四個抽吸/分配循環。
? Z后一次洗滌后，將倒置的平板輕拍到吸水紙上以去除殘留的洗滌液。
? 將 100 μL 底物分配到每個測試孔中，并將板在室溫下孵育 30 分鐘。
? 將 100 μL 終止溶液分配到每個測試孔中。
? 使用 SoftMax Pro 軟件中預先設置的模板，在 VersaMax 酶標上于 450 nm 讀取測試孔的吸光度。
? 使用 SoftMax Pro 軟件繪制校準物曲線。
結果
光密度 (OD) 值用于構建標準曲線。 將校準物繪制為校準物的 OD 值 ( y 軸 ) 與校準物濃度的對數 ( x 軸 ) 的關系。 然后可以通過插入標準曲線公式計算樣品三聚氰胺含量。OD 值大于Z低校準物或小于Z高校準物的樣品必須分別報告為 < 20 ppb 或 >500 ppb。

圖 1 顯示了如上所述繪制的三聚氰胺標準曲線，并帶有 4 參數曲線擬合。 圖 2 顯示了使用半對數曲線擬合繪制的三聚氰胺標準品。通常，4 參數曲線在標準曲線的高端和低端具有更好的擬合度，因此是可取的。
表 1 總結了三聚氰胺孔板試劑盒校準物的數據。使用產品插頁中概述的測試步驟以及用于所需洗滌步驟的AquaMax4000 微孔板清洗機，觀察到了不到 5％ 的出色CV。
結論
Beacon Analytical Systems 公司的三聚氰胺平板試劑盒與 Molecular Devices 公司的 SpectraMax、VersaMax、VMax 和EMax 酶標儀一起，提供了一種質量保證的篩選解決方案，用于檢測食品中的三聚氰胺污染物，例如牛奶、奶粉、酸奶、小麥面筋以及潮濕和干燥的寵物食品。MolecularDevices 的 AquaMax 4000 微孔板清洗機可實現 ELISA 清洗步驟的自動化，擁有出色的重現性，并可與 StakMax微孔板處理系統集成以提高通量。用戶還可以將StakMax 系統與 SpectraMax 和 VersaMax 酶標儀一起配置，以Z大程度地減少手動平板的操作。 完整的數據分析由符合FDA 21 CFR Part 11 的行業標準分析軟件SoftMax Pro GxP 提供。